【摘要】：皮膚是人機(jī)體最重要免疫器官之一，其損傷的修復(fù)是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程,由多種生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子介導(dǎo)。人纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）超家族是參與結(jié)締組織生長(zhǎng)、皮膚愈合的主要因子，人角質(zhì)細(xì)胞因子-2（KGF-2）是該超家族成員之一。KGF-2對(duì)多種因素如急慢性炎癥、潰瘍、物理化學(xué)燒傷等引起的組織器官損傷的修復(fù)過(guò)程發(fā)揮重要作用，并且在整個(gè)脊椎動(dòng)物的胚胎發(fā)育過(guò)程中起著不可替代的作用，參與并調(diào)控多種組織和器官的形成和分化。因此KGF-2有著很好的應(yīng)用前景，在臨床上可以用于治療多種表皮損傷相關(guān)疾病。 本文的主要研究?jī)?nèi)容為成功構(gòu)建了KGF-2重組高效表達(dá)載體；通過(guò)初步發(fā)酵條件優(yōu)化，獲得了穩(wěn)定高表達(dá)的工程菌株；經(jīng)過(guò)純化工藝摸索及優(yōu)化，得到穩(wěn)定簡(jiǎn)便且獲得高純度蛋白的純化工藝，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。純化后的蛋白經(jīng)過(guò)活性檢測(cè)，具有一定的生物學(xué)活性，為以后的科研應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1.通過(guò)優(yōu)化密碼子，成功構(gòu)建了pET-30a(+)-hKGF2重組表達(dá)載體，通過(guò)表達(dá)條件的優(yōu)化獲得高效、可溶性表達(dá)的KGF-2重組蛋白。 2.通過(guò)確定培養(yǎng)基配方、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)pH等發(fā)酵主要條件進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步確立了高密度發(fā)酵條件。 3.建立了適合放大的純化工藝路線，確立了簡(jiǎn)便快捷可線性放大的純化工藝，通過(guò)高壓破菌、Heparin親和層析、超濾脫鹽及DEAE陰離子層析方法，得到了高純度的目標(biāo)蛋白。 4. rhKGF-2對(duì)體外培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)有非常顯著的促進(jìn)作用,在3D氣液培養(yǎng)體系中亦可促進(jìn)組織工程皮膚表皮中角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

-20℃冰箱中保存[41][42]。性核酸內(nèi)切酶酶切技術(shù)ppendorf 管中，依次加入重組質(zhì)粒 DNA10μg、.5ul，NdeI 1.5ul，補(bǔ)水至 20ul，使體系盡量混勻切完全。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，每管可加入 2μl 100mmol/L。酶切結(jié)束后，取少量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 測(cè)序及限制性酶切圖譜的構(gòu)建 雙脫氧中止法進(jìn)行雙鏈 DNA 的核苷酸序列測(cè)定。由核苷酸序列推導(dǎo)出的氨基酸序列比較，采用STAL X(1.8)等進(jìn)行。通過(guò) DNASSIST 2.0 構(gòu)建目

圖 1-2 pET30a(+)-KGF-2 物 圖譜圖 1-3 表達(dá)質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶酶切鑒定圖譜1. Marker 2. 質(zhì)粒 3. PstI 酶切 4. NdeI/ SalI 雙酶切

11 1-3 表達(dá)質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶酶切鑒定圖arker 2. 質(zhì)粒 3. PstI 酶切 4. NdeI/ SalI 雙系統(tǒng)主要有真核表達(dá)體系和原核表達(dá)體細(xì)胞表達(dá)體系、昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系和酵桿菌表達(dá)體系和枯草芽孢桿菌表達(dá)體系晰、易操作、繁殖快、高表達(dá)及成本低達(dá)體系也有易形成包涵體、重組蛋白不KGF-2 是不需糖基化也可表現(xiàn)出良好的生

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王曉杰;周鑫;田海山;馬吉?jiǎng)?焦悅;張睿;蔡敏倩;錢煥文;李校X;;重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2對(duì)兔堿燒傷模型角膜上皮損傷的治療作用[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年04期

本文編號(hào)：2770163