【摘要】： 粘著斑激酶對(duì)β1，4—半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ的表達(dá)和活性調(diào)控 β1，4—半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(Galt)在生物體內(nèi)負(fù)責(zé)參與復(fù)合糖形成和細(xì)胞間的相互作用。GalT在層粘連蛋白上偽足形成和細(xì)胞遷移與粘著斑激酶(FAK)瞬時(shí)酪氨酸磷酸化，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和粘著斑重組有關(guān)。FAK和Galt都定位在粘著斑，都與細(xì)胞骨架相互作用。FAK在整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附到細(xì)胞外基質(zhì)的信號(hào)調(diào)節(jié)中起重要作用。激活FAK引起許多生物學(xué)功能象細(xì)胞粘附，遷移，細(xì)胞生存，凋亡，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和增殖。 細(xì)胞表面的GalT可以作為層粘連蛋白的受體參與由層粘連蛋白引起的多種生物學(xué)行為，包括：促進(jìn)細(xì)胞粘附、轉(zhuǎn)移、分化、軸突的生長、精卵識(shí)別、腫瘤轉(zhuǎn)移等。G1／S調(diào)控點(diǎn)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)p16控制GalT mRNA轉(zhuǎn)錄、表面和總GalT活性。然而，F(xiàn)AK對(duì)Galt的作用尚不清楚。所以我們將野生型FAK(wtFAK)和不同的FAK突變體轉(zhuǎn)染到NIH3T3細(xì)胞系，用Northern blot雜交方法檢測GalT基因表達(dá)，測量它的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)wtFAK和FAKY576F上調(diào)GalT基因表達(dá)和表面酶活性，而FAK的dominant negatiVe突變體FAKY397F下調(diào)Galt基因表達(dá)和表面酶活性。同時(shí)，我們采用ricinus communis agglutinin(RCA)-Ⅰ凝集素染色的方法反映GalT的產(chǎn)物變化。我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染wtFAK和FAKY576F增加細(xì)胞表面半乳糖基，而轉(zhuǎn)染FAKY397F減少細(xì)胞表面半乳糖基。流式細(xì)胞儀分析顯示發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染pcDNA3的NIH3T3細(xì)胞相比，wtFAK和FAKY576F促進(jìn)G1／S期轉(zhuǎn)換，而FAKY397F抑制G1／S期轉(zhuǎn)換。G1／S調(diào)控點(diǎn)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)控制GalT mRNA的轉(zhuǎn)錄。WtFAK和FAKY576F提高cyclin D1，減少p16的表達(dá)，而FAKY397F降低cyclin D1，增加p16的表達(dá)。WtFAK減少cyclin D3，p21的表達(dá)，而FAKY397F和FAKY576F增加cyclin D3，p21的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道細(xì)胞周期抑制基因p16轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，引起細(xì)胞G1期阻滯，導(dǎo)致Galt基因表達(dá)和活性受到抑制。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)wtFAK增加細(xì)胞表面GalT活性，對(duì)總的細(xì)胞GalT活性沒有明顯變化。從這些結(jié)果推測有更多的細(xì)胞周期因子參與FAK對(duì)Galt的表達(dá)和活性的調(diào)控。這些結(jié)果也暗示細(xì)胞周期特定的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)G1／S期轉(zhuǎn)換，諸如Rb-E2F復(fù)合物和E2F-DP復(fù)合物可能參與GalT mRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。已有實(shí)驗(yàn)闡明cyclin D1而不是p21在FAK對(duì)細(xì)胞周期的影響中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)反義cyclin D1能抑制Galt mRNA的表達(dá)。細(xì)胞共轉(zhuǎn)染Galt promoter／luciferase reporter和反義cyclin D1，發(fā)現(xiàn)蟲熒光素酶報(bào)告基因活性明顯下降，表明反義cyclin D1抑制Galt mRNA的表達(dá)可能通過抑制GalT的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果表明NIH3T3細(xì)胞中， FAK調(diào)節(jié)Ga1T的表達(dá)和活性可能與FAK對(duì)細(xì)胞周期的影響有關(guān)。 高度轉(zhuǎn)移的細(xì)胞表面Ga1T表達(dá)升高與它們?cè)隗w外的侵襲特性和體內(nèi)的轉(zhuǎn)移 表型有關(guān)。上述研究表明NIH3T3細(xì)胞中，F(xiàn)AK調(diào)節(jié)GalT的表達(dá)和活性與其對(duì)細(xì) 胞周期的影響有關(guān)。Y397是FAK自磷酸化的主要位點(diǎn)，能夠結(jié)合Src，PI3K和 其它信號(hào)蛋白的SHZ domain。Dominant negative FAK突變體抑制細(xì)胞周期的進(jìn) 展需要Y397，這表明Src和/或磷脂酞肌醇3激酶(P工3K)參與FAK調(diào)節(jié)細(xì)胞周 期這個(gè)過程。FAK/Src相互結(jié)合，隨后激活Erk信號(hào)通路，與整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)的細(xì) 胞周期進(jìn)程有一定的關(guān)系。此外，F(xiàn)AKY397也結(jié)合P工3K，PI3K能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周 期發(fā)展和增殖。這個(gè)結(jié)果提高了FAK可能通過結(jié)合SrC和/或P工3K影響Ga1T mRNA 表達(dá)的可能性。因此我們進(jìn)一步觀察在SMMC一7721細(xì)胞，F(xiàn)AK和它的相互作用分 子對(duì)Ga1T表達(dá)的影響。 不同的FAK和SrC質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SMMC一7721細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)與pcDNA3.l轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 相比，wtFAK增加Ga1T mRNA的表達(dá)，而dooinant negative突變體FAKY397F減少 Ga1T mRNA的表達(dá)。RCA一1 lectin blot研究表明，與對(duì)照細(xì)胞相比，wtFAK轉(zhuǎn)染 的SMMC一7721細(xì)胞膜蛋白中半乳糖基化明顯升高，而FAKY397F轉(zhuǎn)染的細(xì)胞膜蛋白 中半乳糖基化明顯降低。 FAK過表達(dá)增加FAK的酪氨酸磷酸化，而FAKY397F過表達(dá) 減少FAK的酪氨酸磷酸化。WoI’tmannin是P工3K的特異的，有力的抑制劑，它能夠 抑制Ga1T的轉(zhuǎn)錄水平，而wtFAK能夠逆轉(zhuǎn)由wortmannin對(duì)Ga1T的轉(zhuǎn)錄水平的抑制。 這表明除了PI3K，可能還有其它信號(hào)分子同時(shí)影響Ga1T的轉(zhuǎn)錄水平的改變。進(jìn)一 步，我們發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染pKH3空載體的SMMC一7721細(xì)胞相比，pKH3一esreY527F，編碼 持續(xù)激活的Src蛋白，轉(zhuǎn)染SMMC一7721細(xì)胞增加Ga1T的基因表達(dá)，而轉(zhuǎn)染 pKH3一csreK295M，編碼一種dominant negative Sre蛋白，抑制Ga1T的基因表達(dá)。 此外，共轉(zhuǎn)染1.skb Ga1T promoter/lueiferase reporter和wtFAK或持續(xù)激活的 Src蟲熒光素酶報(bào)告基因的活性增加，而dominant negative FAK和 constitutively inaetive Sre與Ga1T promoter/lueiferase reporter共轉(zhuǎn)染， 下調(diào)蟲熒光素酶報(bào)告基因的活性。這些結(jié)果表明SMMC一7721細(xì)胞中，F(xiàn)AK激活P工3K 同時(shí)激活Src，而促進(jìn)Ga1T的基因表達(dá)可能通過促進(jìn)GalT轉(zhuǎn)錄。肝癌細(xì)胞FAK誘導(dǎo) Ga1T高表達(dá)，同時(shí)增加細(xì)胞膜蛋白半乳糖基化。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：Q55

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2772040