【摘要】： 粘著斑激酶對β1，4—半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ的表達和活性調(diào)控 β1，4—半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(Galt)在生物體內(nèi)負責參與復合糖形成和細胞間的相互作用。GalT在層粘連蛋白上偽足形成和細胞遷移與粘著斑激酶(FAK)瞬時酪氨酸磷酸化，肌動蛋白細胞骨架和粘著斑重組有關。FAK和Galt都定位在粘著斑，都與細胞骨架相互作用。FAK在整聯(lián)蛋白介導的細胞粘附到細胞外基質(zhì)的信號調(diào)節(jié)中起重要作用。激活FAK引起許多生物學功能象細胞粘附，遷移，細胞生存，凋亡，細胞周期調(diào)節(jié)和增殖。 細胞表面的GalT可以作為層粘連蛋白的受體參與由層粘連蛋白引起的多種生物學行為，包括：促進細胞粘附、轉(zhuǎn)移、分化、軸突的生長、精卵識別、腫瘤轉(zhuǎn)移等。G1／S調(diào)控點調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)p16控制GalT mRNA轉(zhuǎn)錄、表面和總GalT活性。然而，F(xiàn)AK對Galt的作用尚不清楚。所以我們將野生型FAK(wtFAK)和不同的FAK突變體轉(zhuǎn)染到NIH3T3細胞系，用Northern blot雜交方法檢測GalT基因表達，測量它的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)wtFAK和FAKY576F上調(diào)GalT基因表達和表面酶活性，而FAK的dominant negatiVe突變體FAKY397F下調(diào)Galt基因表達和表面酶活性。同時，我們采用ricinus communis agglutinin(RCA)-Ⅰ凝集素染色的方法反映GalT的產(chǎn)物變化。我們發(fā)現(xiàn)與對照細胞相比，轉(zhuǎn)染wtFAK和FAKY576F增加細胞表面半乳糖基，而轉(zhuǎn)染FAKY397F減少細胞表面半乳糖基。流式細胞儀分析顯示發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染pcDNA3的NIH3T3細胞相比，wtFAK和FAKY576F促進G1／S期轉(zhuǎn)換，而FAKY397F抑制G1／S期轉(zhuǎn)換。G1／S調(diào)控點調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)控制GalT mRNA的轉(zhuǎn)錄。WtFAK和FAKY576F提高cyclin D1，減少p16的表達，而FAKY397F降低cyclin D1，增加p16的表達。WtFAK減少cyclin D3，p21的表達，而FAKY397F和FAKY576F增加cyclin D3，p21的表達。本實驗室報道細胞周期抑制基因p16轉(zhuǎn)染A549細胞，引起細胞G1期阻滯，導致Galt基因表達和活性受到抑制。而本實驗發(fā)現(xiàn)wtFAK增加細胞表面GalT活性，對總的細胞GalT活性沒有明顯變化。從這些結(jié)果推測有更多的細胞周期因子參與FAK對Galt的表達和活性的調(diào)控。這些結(jié)果也暗示細胞周期特定的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)G1／S期轉(zhuǎn)換，諸如Rb-E2F復合物和E2F-DP復合物可能參與GalT mRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。已有實驗闡明cyclin D1而不是p21在FAK對細胞周期的影響中起重要作用。本實驗進一步發(fā)現(xiàn)反義cyclin D1能抑制Galt mRNA的表達。細胞共轉(zhuǎn)染Galt promoter／luciferase reporter和反義cyclin D1，發(fā)現(xiàn)蟲熒光素酶報告基因活性明顯下降，表明反義cyclin D1抑制Galt mRNA的表達可能通過抑制GalT的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果表明NIH3T3細胞中， FAK調(diào)節(jié)Ga1T的表達和活性可能與FAK對細胞周期的影響有關。 高度轉(zhuǎn)移的細胞表面Ga1T表達升高與它們在體外的侵襲特性和體內(nèi)的轉(zhuǎn)移 表型有關。上述研究表明NIH3T3細胞中，F(xiàn)AK調(diào)節(jié)GalT的表達和活性與其對細 胞周期的影響有關。Y397是FAK自磷酸化的主要位點，能夠結(jié)合Src，PI3K和 其它信號蛋白的SHZ domain。Dominant negative FAK突變體抑制細胞周期的進 展需要Y397，這表明Src和/或磷脂酞肌醇3激酶(P工3K)參與FAK調(diào)節(jié)細胞周 期這個過程。FAK/Src相互結(jié)合，隨后激活Erk信號通路，與整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)的細 胞周期進程有一定的關系。此外，F(xiàn)AKY397也結(jié)合P工3K，PI3K能夠調(diào)節(jié)細胞周 期發(fā)展和增殖。這個結(jié)果提高了FAK可能通過結(jié)合SrC和/或P工3K影響Ga1T mRNA 表達的可能性。因此我們進一步觀察在SMMC一7721細胞，F(xiàn)AK和它的相互作用分 子對Ga1T表達的影響。 不同的FAK和SrC質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染SMMC一7721細胞。發(fā)現(xiàn)與pcDNA3.l轉(zhuǎn)染的細胞 相比，wtFAK增加Ga1T mRNA的表達，而dooinant negative突變體FAKY397F減少 Ga1T mRNA的表達。RCA一1 lectin blot研究表明，與對照細胞相比，wtFAK轉(zhuǎn)染 的SMMC一7721細胞膜蛋白中半乳糖基化明顯升高，而FAKY397F轉(zhuǎn)染的細胞膜蛋白 中半乳糖基化明顯降低。 FAK過表達增加FAK的酪氨酸磷酸化，而FAKY397F過表達 減少FAK的酪氨酸磷酸化。WoI’tmannin是P工3K的特異的，有力的抑制劑，它能夠 抑制Ga1T的轉(zhuǎn)錄水平，而wtFAK能夠逆轉(zhuǎn)由wortmannin對Ga1T的轉(zhuǎn)錄水平的抑制。 這表明除了PI3K，可能還有其它信號分子同時影響Ga1T的轉(zhuǎn)錄水平的改變。進一 步，我們發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染pKH3空載體的SMMC一7721細胞相比，pKH3一esreY527F，編碼 持續(xù)激活的Src蛋白，轉(zhuǎn)染SMMC一7721細胞增加Ga1T的基因表達，而轉(zhuǎn)染 pKH3一csreK295M，編碼一種dominant negative Sre蛋白，抑制Ga1T的基因表達。 此外，共轉(zhuǎn)染1.skb Ga1T promoter/lueiferase reporter和wtFAK或持續(xù)激活的 Src蟲熒光素酶報告基因的活性增加，而dominant negative FAK和 constitutively inaetive Sre與Ga1T promoter/lueiferase reporter共轉(zhuǎn)染， 下調(diào)蟲熒光素酶報告基因的活性。這些結(jié)果表明SMMC一7721細胞中，F(xiàn)AK激活P工3K 同時激活Src，而促進Ga1T的基因表達可能通過促進GalT轉(zhuǎn)錄。肝癌細胞FAK誘導 Ga1T高表達，同時增加細胞膜蛋白半乳糖基化。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：Q55

【共引文獻】

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本文編號：2772040