【摘要】：研究背景呼吸道傳染病至今仍然是世界上導(dǎo)致死亡的主要原因之一，而流感病毒（Influenza virus，F(xiàn)LU）和呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）則是重要的呼吸道病原體。目前，流感已有安全有效的不同類型疫苗，為流感的防控提供了保證。而RSV由于自身免疫特性，至今沒(méi)有批準(zhǔn)使用的疫苗，為其防控提出了挑戰(zhàn)。RSV是嬰幼兒下呼吸道感染最重要的病原，也是造成老年人和免疫缺陷成人住院和肺炎死亡的重要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，6個(gè)月以內(nèi)的嬰幼兒因RSV感染導(dǎo)致住院達(dá)70%，2周歲以內(nèi)的兒童甚至高達(dá)99%。RSV因其致病范圍廣，病情高發(fā)，且會(huì)引起嚴(yán)重的并發(fā)癥等，給人類健康和生命安全造成了嚴(yán)重威脅。 RSV屬副粘病毒科肺病毒屬的非節(jié)段性單股負(fù)鏈RNA病毒，含A、 B兩個(gè)血清型。RSV基因組全長(zhǎng)約15Kb，編碼10種主要蛋白，分別由三個(gè)跨膜蛋白（G、F和SH）、兩個(gè)基質(zhì)蛋白（M和M2）、三個(gè)核衣殼蛋白（N、P和L）及兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1和NS2）構(gòu)成，其中融合蛋白F（Fusion protein，F(xiàn)）和附著蛋白G（Attchment protein，G）是RSV激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體最重要的病毒蛋白。G蛋白易變異，并非感染和細(xì)胞融合所必須的；F蛋白能夠穩(wěn)定遺傳，單獨(dú)的F蛋白就可引起細(xì)胞融合病變。針對(duì)RSV F和G糖蛋白的全身性中和抗體能有效防止RSV再感染，因此RSV F和G蛋白已作為公認(rèn)的保護(hù)性抗原和毒力致病分子。 疫苗是控制傳染病最有效的手段之一。對(duì)于RSV而言，20世紀(jì)60年代，F(xiàn)ulginiti VA等研制的福爾馬林滅活疫苗（FI-RSV）由于誘發(fā)Th2型免疫過(guò)激導(dǎo)致2名兒童死亡和80%住院以失敗告終。目前RSV疫苗的研究主要集中在載體疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗、VLP疫苗，已有多種疫苗類型正在研制，但至今無(wú)獲批的RSV疫苗可用。RSV疫苗的研究一直是國(guó)際社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)，從已有的研制中的RSV疫苗可見(jiàn)，注射免疫不能產(chǎn)生有效的粘膜和細(xì)胞免疫反應(yīng)且免疫保護(hù)效果受限、DNA疫苗存在潛在安全性以及全長(zhǎng)F、G蛋白疫苗存在潛在Th1/Th2失平衡等瓶頸問(wèn)題亟待解決。近年來(lái)，隨著流感病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)日亦成熟及流感病毒載體的自身優(yōu)勢(shì)，以流感病毒作為遞送系統(tǒng)成功研發(fā)的RSV疫苗候選株能夠產(chǎn)生雙重免疫保護(hù)效果，且安全性高、易于操作，具有廣闊的發(fā)展前景，有望為RSV疫苗研究提供新的思路。研究目的采用流感病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)重配篩選出流感病毒為載體的重組FLU-RSV疫苗株；對(duì)重組FLU-RSV疫苗進(jìn)行全面的鑒定，進(jìn)而免疫動(dòng)物和攻毒，評(píng)價(jià)重組FLU-RSV疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)性，為發(fā)展RSV疫苗和實(shí)現(xiàn)“一苗兩用”提供思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法和結(jié)果 第一部分流感病毒為載體的重組FLU-RSV疫苗株的構(gòu)建及鑒定 首先，采用免疫抗原生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和文獻(xiàn)調(diào)研，篩選并確定RSV F保護(hù)性抗原表位F205-223（PIVNKQSCRI SNIETVIEF）和F255-278（SELLSLINDMPITNDQKK LMSNNV），以及G保護(hù)性抗原表位G142-204（QPSKPTTKQRQNKPPNKPNN DFHFEVFNFV PCSICSNNPT CWAICKRIPN KKPGKKTTTKPTK）。F保護(hù)性抗原表位使用GPG Linker連接，并將F205-223-GPG-F255-278命名為F， G142-204命名為G。將RSV抗原表位F、G和F+G分別插入到流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因片段中，基因NS1-F、NS1-G和NS1-F+G分別與雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pHW2000通過(guò)BSmBⅠ酶切、切膠回收、目的質(zhì)粒與pHW2000載體連接、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)及菌液PCR等構(gòu)建重組質(zhì)粒。當(dāng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性條帶、菌液送生工測(cè)序與預(yù)期序列吻合，表明重組質(zhì)粒NS1-F、NS1-G和NS1-F+G構(gòu)建成功。 重組質(zhì)粒NS1-F、NS1-G和NS1-F+G分別與已構(gòu)建的流感病毒7質(zhì)粒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA和M通過(guò)“7+1”組合，采用Effectene將流感病毒8質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-1/MDCK細(xì)胞，其中以重組質(zhì)粒代替NS質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染；24h后將6孔板中的培養(yǎng)基換成0.8μg/mL TPCK胰酶的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液；48h后吸取上清進(jìn)行血凝初檢。當(dāng)發(fā)現(xiàn)血凝陽(yáng)性結(jié)果，將該孔的細(xì)胞及上清接種9日齡SPF雞胚。3天后吸取尿囊液，進(jìn)行血凝復(fù)檢，結(jié)果顯示陽(yáng)性。重組FLU-RSV疫苗病毒液接種雞胚，連傳3代能穩(wěn)定遺傳，表明重組FLU-RSV疫苗株重配成功，我們將其分別命名為rFLU/RSV/F、rFLU/RSV/G和rFLU/RSV/F+G。 重配成功的重組FLU-RSV疫苗病毒株經(jīng)接種雞胚擴(kuò)增、30KD超濾膜包濃縮、30%-60%蔗糖密度梯度純化，測(cè)定其血凝效價(jià)和CCID50病毒滴度。Westernblot檢測(cè)成功表達(dá)RSV特異性的蛋白，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)重組FLU-RSV疫苗病毒株的大小分布及粒子結(jié)構(gòu)符合流感病毒的形態(tài)特征，細(xì)胞培養(yǎng)顯示重組FLU-RSV病毒可在MDCK、 A549和CNE-2Z細(xì)胞有效復(fù)制。以上結(jié)果表明，成功重配了流感病毒為載體的重組FLU-RSV疫苗株。 第二部分流感病毒為載體的重組FLU-RSV疫苗免疫原性和免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià) 選用6周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為7組，每組30只。采用上述成功重配的rFLU/RSV/F、rFLU/RSV/G和rFLU/RSV/F+G疫苗株為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)立104CCID50和105CCID50兩個(gè)劑量組，并用0.01M PBS為對(duì)照組。小鼠按上述劑量進(jìn)行滴鼻免疫，20μL/只。0天、28天免疫，共2次。免疫前、初免后4周和二免（加強(qiáng)免疫）后2周收集小鼠血清、肺鼻灌洗液及脾淋巴細(xì)胞懸液。取免疫小鼠血清測(cè)定針對(duì)流感病毒和RSV的中和抗體效價(jià)和針對(duì)RSV的IgG類抗體及亞型IgG1和IgG2a的滴度，用于評(píng)價(jià)重組FLU-RSV疫苗株的免疫原性；取小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液測(cè)定針對(duì)RSV的細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ和TNF-α，用于評(píng)價(jià)Th1/Th2系統(tǒng)免疫應(yīng)答平衡；取小鼠肺鼻灌洗液測(cè)定RSV特異性的抗體sIgA效價(jià)，用于評(píng)價(jià)重組FLU-RSV疫苗株的粘膜免疫應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rFLU/RSV/F、rFLU/RSV/G和rFLU/RSV/F+G疫苗株在小鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生針對(duì)流感病毒和RSV的中和抗體，產(chǎn)生針對(duì)RSV的Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)及粘膜免疫反應(yīng)，且Th1/Th2免疫應(yīng)答平衡，而PBS對(duì)照組陰性。同時(shí)，rFLU/RSV/F+G疫苗株的免疫原性優(yōu)于rFLU/RSV/F和rFLU/RSV/G。由此初步推斷，rFLU/RSV/F+G疫苗株是最有潛力的RSV候選疫苗株。 采用加強(qiáng)免疫2周后的各組小鼠，每組20只，分別用當(dāng)前流行病毒株，即PR8流感病毒野生株（100LD50）和RSV A2株（2×106PFU/mL）對(duì)小鼠進(jìn)行滴鼻攻毒，連續(xù)2周記錄小鼠病毒攻擊后的體重變化及存活情況。PR8流感病毒攻毒第四天測(cè)定小鼠肺和鼻甲骨組織的病毒載量，HE染色觀察肺病理變化；RSV A2株攻毒第六天測(cè)定小鼠肺和鼻甲骨組織的病毒載量，HE染色觀察肺病理變化，并計(jì)數(shù)小鼠支氣管肺泡灌洗液中的炎性細(xì)胞總量及各個(gè)炎性細(xì)胞數(shù)量，主要包括嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、小單核細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。攻毒結(jié)果顯示，rFLU/RSV/F、rFLU/RSV/G和rFLU/RSV/F+G疫苗株能對(duì)免疫小鼠產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)效果，且免疫保護(hù)效率提示rFLU/RSV/F+G＞rFLU/RSV/F＞rFLU/RSV/G，進(jìn)一步表明rFLU/RSV/F+G疫苗株具有顯著地免疫原性和免疫保護(hù)效果，能有效提高機(jī)體的體液、細(xì)胞及粘膜免疫應(yīng)答，是最有潛力的流感病毒為載體的RSV疫苗候選株。結(jié)論通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)成功重配篩選出以流感病毒為載體的重組FLU-RSV疫苗株。鑒定結(jié)果顯示rFLU/RSV/F、rFLU/RSV/G和rFLU/RSV/F+G疫苗株可在MDCK、A549和CNE-2Z細(xì)胞有效復(fù)制、重組病毒形態(tài)與流感病毒相符且表達(dá)RSV特異性的保護(hù)性抗原蛋白。免疫原性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，重組FLU-RSV疫苗在小鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生針對(duì)流感病毒和RSV的中和抗體，產(chǎn)生針對(duì)RSV的Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)及粘膜免疫反應(yīng)。攻毒結(jié)果表明，重組FLU-RSV疫苗株對(duì)免疫小鼠具有顯著的免疫保護(hù)效果，可以同時(shí)抵抗流感病毒和RSV的感染，且rFLU/RSV/F+G疫苗株突顯更大的優(yōu)勢(shì)。以上研究為發(fā)展RSV新型疫苗及實(shí)現(xiàn)“一苗兩用”提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373.13;R392
【圖文】：

克隆載體pHW2000的全序列

圖 2 克隆載體 pHW2000Fig.2 The cloning vector pHW2000合成的重組質(zhì)粒 NS1-F、NS1-G 和 NS1-F+G 及實(shí)體進(jìn)行酶切，酶切體系如下：酶切反應(yīng)體系體積（μL）組成 體積（μL）組成 體積（μL）組成1.5 BSmBⅠ 1.5 BSmBⅠ 1.5 BSmB4 Buffer 3 4 Buffer 3 4 Buffe34.5 NS1-G 34.5 NS1-F+G 34.5 pHW20

重組質(zhì)粒NS1-F全序列

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本文編號(hào)：2768823