發(fā)布時(shí)間：2020-07-24 09:45

【摘要】：諾如病毒(NoVs)是世界范圍內(nèi)流行性急性胃腸炎的最主要病原體之一。無論發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家,各個(gè)年齡段中NoV都有很高的感染率。美國(guó)疾病控制中心(CDC)估計(jì),僅美國(guó)每年有至少2300萬例NoV導(dǎo)致的病毒性胃腸炎病例,每年因NoV胃腸炎導(dǎo)致直接治療費(fèi)用和間接所致的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)億美元。 由于缺乏細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),亦無合適的動(dòng)物感染模型,一直以來NoV發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展緩慢。目前尚缺乏針對(duì)NoV胃腸炎的有效疫苗及抗病毒藥物。近年來,隨著國(guó)外學(xué)者對(duì)NoV基因組結(jié)構(gòu)和衣殼蛋白研究的日益深入,24聚體的P顆粒成為該領(lǐng)域的研究創(chuàng)造了物質(zhì)基礎(chǔ)和新的研究思路。利用P區(qū)域蛋白(P顆粒)與生物合成的人類組織血型抗原(HBGA)受體抗原(A型/B型三糖)進(jìn)行共結(jié)晶的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)研究,結(jié)果表明其受體結(jié)合位點(diǎn)位于P2亞區(qū),即P區(qū)域的最外端。P顆粒具有與VLPs相似的立體空間結(jié)構(gòu),及天然結(jié)合宿主HBGA受體特性和高免疫原性,提示P顆�？捎糜谔剿鱊oV受體結(jié)合及疫苗研制的理想模型。 本研究在開展了1974-2012年間流行的NoV優(yōu)勢(shì)株GⅡ.4型毒株的基因遺傳分析基礎(chǔ)上,以表達(dá)的P顆粒為主要研究對(duì)象,進(jìn)行了不同時(shí)期GⅡ.4型毒株P(guān)顆粒與HBGAs受體的結(jié)合方式和不同毒株的抗原關(guān)聯(lián)性研究。旨在討論宿主受體因素及宿主免疫因素在GⅡ.4的進(jìn)化中所起的作用,為制定NoV疫苗策略提供依據(jù)。同時(shí)研究了抗P顆粒單價(jià)及抗P-VP8*嵌合P顆粒雙價(jià)IgY抗體在NoV及輪狀病毒(RV)感染中的被動(dòng)免疫保護(hù)作用。 (一)HBGAs受體選擇在GⅡ.4型NoV流行進(jìn)化中的分子機(jī)制研究 NoV的遺傳基因和抗原性呈高度多樣性,根據(jù)病毒RNA聚合酶編碼區(qū)核苷酸或外殼蛋白區(qū)氨基酸序列的差異可將NoV分成5個(gè)基因組。其中GⅠ、GⅡ、GⅣV基因組主要感染人類,GⅡ、GⅢ、GⅣ和GV組可分別感染豬、牛、犬及鼠。GⅠ、GⅡ又可以進(jìn)一步細(xì)分為至少8和21個(gè)基因型,每個(gè)基因型包括多個(gè)變異毒株。自上世紀(jì)90年代中期開始,GⅡ.4基因型持續(xù)高流行。僅此一個(gè)基因型別就占了NoV世界范圍內(nèi)流行的60%以上,且每隔1-3年便產(chǎn)生新的變種,據(jù)此,有學(xué)者提出宿主免疫選擇可能是導(dǎo)致NoV不斷進(jìn)化的因素之一。 然而,我們團(tuán)隊(duì)通過前期研究提出HBGA受體對(duì)GⅡ.4型NoV分子進(jìn)化的強(qiáng)選擇是其分子進(jìn)化的重要機(jī)制的假說：即在宿主變異的推動(dòng)下,病毒的抗原性持續(xù)的改變；同時(shí)HBGAs作為趨同因素,通過對(duì)病毒結(jié)構(gòu)的限制起到功能性的選擇作用,即HBGA受體選擇在GⅡ.4NoV分子進(jìn)化中亦發(fā)揮著重要作用。 為了進(jìn)一步闡明并驗(yàn)證該假說,本研究對(duì)1974-2012年間流行的82株GIⅡ.4型病毒株進(jìn)行了遺傳分析,HBGA受體結(jié)合域氨基酸保守性分析顯示該區(qū)域氨基酸高度保守：S343(100%,即82株第343個(gè)氨基酸100%為S),T344(100%),R345(100%), D374(100%), S441(100%), G442(98.8%)和Y443(100%),結(jié)果表明NoV表面的HBGA受體結(jié)合區(qū)域高度保守�；谀壳翱色@得的NoV晶體結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行序列深入分析,發(fā)現(xiàn)GⅡ.4NoV的HBGA受體結(jié)合界面形成了高度保守的口袋樣受體結(jié)合域并能與HBGA抗原的重要位點(diǎn)結(jié)合�？诖鼧邮荏w結(jié)合域周圍則存在相對(duì)具有變異性的結(jié)構(gòu),該變異性結(jié)構(gòu)主要負(fù)責(zé)與HBGA抗原的另外一個(gè)寡糖結(jié)合。 利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)2000-2012年間加拿大阿爾伯特地區(qū)流行的10株GⅡ.4型NoV P顆粒(其中6株為新現(xiàn)的2008b和2010基因簇),通過唾液HBGA結(jié)合鑒定及人造寡聚糖(生物合成)HBGA結(jié)合鑒定實(shí)驗(yàn)表明：雖然不同株別的P顆粒結(jié)合A、B、H抗原的親和力存在不同程度的差異,但所有10株GⅡ.4NoV均能結(jié)合分泌型HBGA。由于分泌型人群占到總?cè)巳旱?0%-85%,GⅡ.4的高流行與其與HBGA的結(jié)合譜相一致,說明GⅡ.4高流行正是在HBGA的選擇下NoV長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果。 在此基礎(chǔ)上,我們利用GⅡ.4志愿者攻毒試驗(yàn)獲得的配對(duì)血清開展了血清學(xué)抗原性分析,研究發(fā)現(xiàn)1998-2012年間14個(gè)變異株之間存在顯著的交叉抗原性,通過HBGA受體阻斷實(shí)驗(yàn)(NoV體外中和實(shí)驗(yàn)替代模型)亦發(fā)現(xiàn)志愿者血清對(duì)不同毒株具有交叉阻斷能力,提示GⅡ.4感染產(chǎn)生的抗體對(duì)不同變異株存在交叉保護(hù)作用。 研究結(jié)果為GⅡ.4型NoV分子進(jìn)化機(jī)制及疫苗研制策略提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。即：①高度保守的口袋樣受體結(jié)合域?yàn)樗拗鱄BGA受體因素強(qiáng)選擇的結(jié)果,這將為研制抗GⅡ.4NoV疫苗提供重要依據(jù)；②序列中變異區(qū)域?yàn)镠BGA和宿主免疫共選擇的結(jié)果。同時(shí)由于GⅡ基因組NoV的HBGA口袋樣受體結(jié)合域亦相對(duì)保守,進(jìn)一步深入研究GⅡ NoV抗原交叉反應(yīng)性將為下一步研制更為廣譜的NoV疫苗提供依據(jù)。 (二)抗NoV P顆粒單價(jià)IgY抗體的制備及其HBGA受體阻斷作用 被動(dòng)免疫是預(yù)防和治療感染性疾病的有效策略。利用哺乳動(dòng)物血清中提取的抗體進(jìn)行口服治療的研究已有報(bào)道。但是,由于在哺乳動(dòng)物中進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)抗體的花費(fèi)高,使得其應(yīng)用一直受到限制。與多克隆抗體相比,用單克隆抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫所產(chǎn)生的保護(hù)水平也較低。雞IgY由于其生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量而成為是被動(dòng)保護(hù)抗體的一種有效選擇。近幾年,多個(gè)研究表明雞IgY對(duì)粘膜病原體,特別是病原體引起的腸道內(nèi)感染非常有效。 本研究采用NoVs P顆粒蛋白免疫來航雞,制備了NoV特異性IgY抗體。結(jié)果顯示：雞蛋蛋黃中自第3周開始產(chǎn)生特異性抗體,到第7周抗體滴度達(dá)到最高并一直持續(xù)到第16周,抗體滴度達(dá)到200,000-500,000,平均每個(gè)雞蛋中NoVs特異性抗體含量高達(dá)4.7-9.2mg。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)表明從蛋黃中分離的IgY抗體與NoVs P顆粒有很強(qiáng)的免疫反應(yīng),并且能阻斷NoVs病毒樣顆粒(VLPs)及P顆粒與HBGA受體結(jié)合(NoV體外中和實(shí)驗(yàn)替代模型),BT50為1：800。雞IgY在70℃溫育30分鐘或者在pH4-9的環(huán)境中處理3小時(shí)后仍能保持80%以上的HBGA受體阻斷活性。NoVs IgY抗體滴度高、產(chǎn)量高,具有在胃腸道中穩(wěn)定性好、成本低廉等特點(diǎn),為抗NoV感染的被動(dòng)免疫治療提供了潛在的應(yīng)用前景。 (三)抗P-VP8*嵌合P顆粒IgY抗體的制備及其對(duì)NoV/RV的雙價(jià)免疫保護(hù)作用 輪狀病毒(RVs)和NoVs是導(dǎo)致病毒性腹瀉最主要的兩種病原體。RVs每年在世界范圍內(nèi)引起1.385億嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉,包括造成2500萬的就診量,超過200萬的住院量和453,000五歲以下兒童死亡。RVs和NoVs在兒童和/或老年人中引起嚴(yán)重的疾病,并在免疫受損的病人中造成持續(xù)性感染。因此,被動(dòng)免疫策略來控制和預(yù)防臨床RVs和NoVs的感染是有必要的。 本研究利用P-VP8*嵌合P顆粒蛋白免疫來航雞,成功大規(guī)模制備了抗人類NoVs和RVs的雙價(jià)特異性IgY抗體。在首次免疫后第二周的血清和第四周的蛋黃中就檢測(cè)到P-VP8*抗體,特異性抗NoV抗體滴度與單獨(dú)用NoV P顆粒免疫獲得的抗體滴度相似(750,000-800,0000),而其抗RV VP8*抗體滴度(～80,000)顯著性高于單獨(dú)用VP8*抗原免疫獲得的滴度(～48,000)。Western blot分析結(jié)果表明抗P-VP8*IgY與NoV VLP和RV VP8*具有特異性反應(yīng)。HBGA受體阻斷實(shí)驗(yàn)表明：抗P-VP8*IgY具有阻斷NoV與HBGA受體A、B抗原的結(jié)合能力(BT50為1：1,200-1：1,300)；同時(shí)具有阻斷RV與HBGA Leb (BT50為1：80)及H-1抗原(BT50為1：240)的結(jié)合能力。RV體外中和蝕斑實(shí)驗(yàn)及免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示抗P-VP8*IgY可阻斷Wa毒株的體外復(fù)制(IC50為0.304mg/ml)。利用CPE及Western blot分析,發(fā)現(xiàn)抗P-VP8*IgY對(duì)體外RV病毒接種前(預(yù)防)、接種后(治療)復(fù)制具有抑制作用。研究結(jié)果表明P-VP8*誘導(dǎo)的IgY具有開發(fā)出一種同時(shí)有效預(yù)防和治療NoV和RV感染的免疫制劑的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：2768661