【摘要】：異基因造血干細胞移植(alloHSCT)是治療惡性血液病的有效手段，完全相合的供者越來越少，迫使人們研究HLA半相合供源的干細胞移植。與HLA全相合比較，HLA半相合HSCT有良好的殺傷腫瘤效應(yīng)。然而，HLA半相合HSCT發(fā)生移植失敗和移植物抗宿主病(GVHD)的比例也相應(yīng)增加。新的研究定位點是在保留半相合HSCT移植物抗白血病(GVL)的前提下，如何降低GVHD，減少移植并發(fā)癥，提高移植后受者生活質(zhì)量。目前采用的去除T淋巴細胞、篩選干細胞移植物和加大免疫抑制劑的用量，不能滿足上述標(biāo)準(zhǔn)。新的研究方向轉(zhuǎn)移到了采用免疫細胞進行調(diào)節(jié)。NK細胞具有殺傷腫瘤、抗感染的能力，但在半相合HSCT中的移植免疫調(diào)節(jié)的確切作用還不清楚，本研究在C_(57)BL／6~(H-2b)→CB6F_1~(H-2b/d)小鼠骨髓移植模型上觀察供者NK細胞在半相合骨髓移植中的作用，為臨床在半相合骨髓移植中應(yīng)用NK細胞提供實驗依據(jù)，確立NK細胞的免疫調(diào)節(jié)作用，將會使92％以上的患者得到移植治療。 實驗方法 一、供者NK細胞在小鼠MHC半相合骨髓移植造血重建及免疫耐受的研究： 制備CB6F_1~(H-2b/d)小鼠為受者，C_(57)BL／6~(H-2b)小鼠為供者。90只CB6F_1~(H-2b/d)小鼠經(jīng)9.0Gy照射后隨機分為9組，每組10只。對照組(共4組)：對照1組為單純照射組；對照2組為半相合骨髓細胞移植組；照射后4h移植C_(57)BL／6~(H-2b)小鼠骨髓細胞；對照3組為同基因骨髓細胞移植組：照射后4h移植CB6F_1~(H-2b/d)小鼠骨髓細胞；對照4組為半相合GVHD對照組：照射后4h移植C_(57)BL／6~(H-2b)小鼠骨髓細胞和脾細胞。實驗組(共5組)：實驗1、2、3組為CB6F_1~(H-2b/d)小鼠在照射后1h內(nèi)首先移植純化 第一軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 的c57BLz6H-2b小鼠NK細胞，劑量分別為1 x 10今只、5 x 105/只和2 xlo今 只，在照射后4h移植Cs尹L/6H一小鼠骨髓細胞;實驗4、5組為照射后 1h內(nèi)分別移植C57BL/護一小鼠NK細胞1 xlo今只、5 x 105/只，在照射 后4h移植CS尹L/護一小鼠骨髓細胞和脾細胞。以血象、體重、生存期和 病理組織學(xué)變化為觀察指標(biāo)并作組間比較。 二、供者NK細胞抗白血病作用的體內(nèi)研究: 建立荷EL%11(H一Zd)紅白血病細胞的cB6FIH一小鼠動物模型， 30只紅白血病小鼠隨機分為5組，每組6只。對照組(共3組):對照1 組為未治療組;對照2組為阿糖胞昔治療組:小鼠注入EL9611(H一Zd) 細胞后第5天開始腹腔注射阿糖胞昔50m留(kg·只)X6d;對照3組為同 基因NK細胞治療組:注射EL9611(H一Zd)細胞后第5天每只小鼠輸注 eB6FIH一小鼠NK細胞1又一06/只x ld。實驗組(共2組):實驗l、2 組為注射 EL9611(H一Zd)細胞后第5天每只小鼠輸注Cs7Bu護一小鼠 NK細胞，劑量分別為2 x 105/只xld、5 xlo今只xld。以血象、體重、 生存期和病理組織學(xué)變化為觀察指標(biāo)并作組間比較。 三、供者NK細胞對小鼠半相合骨髓移植的GVHD與GVL的作用: 建立荷EL%11(H一Zd)紅白血病細胞的cB6FIH一小鼠動物模型， 5天后隨機分為7組，每組10只，移植組在gGy照射后行Cs7BL/護-2b 一cB6FIH~方向骨髓移植。對照組(共5組):對照1組為未治療組; 對照2組為單純照射組;對照3組為阿糖胞昔治療組:小鼠腹腔注射阿 糖胞昔50mg/(kg·只)X6d;對照4組為單純骨髓細胞移植組:小鼠照射 后4h移植C57BL/6H-2b’J、鼠骨髓細胞;對照5組為GvHD對照組:小鼠 照射后4h移植CS尹u6H一小鼠骨髓細胞和脾細胞。實驗組(共2組): 實驗1組，照射后輸注CS舊u6H-2b小鼠NK細胞1 x 10今只，4h后移植 C57BL/護一小鼠骨髓細胞;實驗2組:照射后同實驗1組，4h后移植 C57Bu6H-Zb小鼠骨髓細胞和脾細胞。以血象、體重、生存期和病理組織 學(xué)變化為觀察指標(biāo)并作組間比較。 四、供者NK細胞促進小鼠半相合骨髓細胞植入: 制備cB6FIH一確小鼠為受者，C57BL/6H一小鼠為供者。60只小鼠根 據(jù)不同照射劑量及不同NK細胞輸注量分為10組。對照組(共6個組): 對照1、3、5組均為單純照射組，照射劑量分別為gGy、7Gy、6Gy;對 6 第一軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 照2、4、6組均為半相合骨髓細胞移植組:照射后4h移植骨髓細胞，照 射劑量分別為gGy、7Gy、6Gy;實驗組(共4各組):實驗1、3組，照 射后lh內(nèi)移植Cs7Bu護一小鼠NK細胞1 x 10今只，4h后移植C57BL/6H一2b 小鼠骨髓細胞，照射劑量分別為7Gy、6Gy;實驗2、4組，照射后lh 內(nèi)移植e57BL/OH一b小鼠NK細胞5 x 105/只，4h后移植e57BL/6H一小鼠 骨髓細胞，照射劑量分別為7Gy、6Gy。以血象、生存期和嵌合體比例 為觀察指標(biāo)并作組間比較。 實驗結(jié)果 一、供者NK細胞在MHC半相合骨髓移植造血重建及免疫耐受的 研究: 1.生存期:在半相合移植模型上證實，對照1組為(5.巧士0.66)d， 對照4組為(15.80士1.93)d，其他組小鼠生存期均大于3Od: 2.病理學(xué)結(jié)果，對照4組出現(xiàn)典型的GVHD病理表現(xiàn)，其他各組 均無GVHD病理表現(xiàn); 3.移植后+10d時白細胞及血小板計數(shù):對照2組WBC為 (0.9妊0.22)x 109幾、PLT為(61.肚7.27) x 10玩。實驗1、2、3組 wBe計數(shù)分別為(2.01士0.21)x log/L、(1.95切.29)xlog/L、(1.97土0.21) 、log/L;PLT計數(shù)分別為(101
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R392
【圖文】：

圖3KIR一叩itope而smatchinh叩lotyPe側(cè)smatchedstemeell加n印lantation(A)供受者是HLA半相合配對，且HLA一c位點KIR錯配。供者NK細胞克隆表達KIRZDLI，由HLA一CZ組基因(HLA一CwZ，4，5和6)識別和抑制。受者白血病細胞表達HLA一w3，是HLA一1組成員，故激活供者NK細胞發(fā)揮殺傷白血病細胞效應(yīng)。(B)供受者是HLA半相合配對，但HLA一c位點同樣都是HLA一cZ組成員(HLA一CwZ，4，5，6)。因此，供者NK細胞克隆表達抑制受體MRZDLI，識別受者的HLA一Cw4，因而抑制殺傷白血病細胞作用。

圖6免疫磁珠分選原理示意圖(四)NK細胞的檢測分選后的細胞進行流式細胞標(biāo)記胞的純度。取待測標(biāo)本50貝，加10川相應(yīng)的熒光McAb，避光處，室溫孵育30min。分離前后的標(biāo)本均作標(biāo)記，加入裂放置5一10min，懸浮細胞，加入PBsZITil，1000轉(zhuǎn)/分，離棄上清液，懸浮細胞，加入固定液450川，混勻，放置2一8℃待上機分析。(五)供者NK細胞的輸注純化后的NK細胞用生理鹽(1500轉(zhuǎn)/分，5而n)，調(diào)細胞數(shù)4X106/ml，照射后1小時內(nèi)小鼠體內(nèi)。(六)骨髓移植按文獻〔30]方法，常規(guī)取C57BL/6H一2b小鼠骨髓制成單溶解紅細胞后調(diào)整細胞數(shù)2x107/ml;用于半相合BMT。同臟，制備脾細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)濃度，脾細胞2x108/ml，

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本文編號：2768544