【摘要】： 研究目的：瘧疾尤其是惡性瘧目前仍然是世界上嚴重危害人類健 康的主要傳染病之一，研制有效的抗瘧疫苗具有重要的理論意義和實際 應用價值。由于瘧原蟲復雜的生活史、繁多的抗原成分及強大的免疫逃 避能力，迄今在研究有效實用的瘧疾疫苗方面還沒有取得令人滿意的成 果。DNA疫苗技術(shù)的出現(xiàn)為疫苗的研制開辟了新的途徑。與傳統(tǒng)的蛋白 多肽類疫苗相比，DNA疫苗具有諸多優(yōu)點：它可在體內(nèi)持續(xù)表達與天然 抗原構(gòu)象相似的抗原蛋白；不但可誘導機體的體液免疫，產(chǎn)生抗原特異 性抗體，也可誘導機體的細胞免疫，產(chǎn)生細胞毒T細胞，而細胞免疫對 于抵御像瘧原蟲這樣的胞內(nèi)寄生蟲感染十分重要。 本實驗室利用基因工程重組技術(shù)，合成了一個編碼惡性瘧原蟲不同 發(fā)育階段抗原表位的保護性抗原復合基因HGFSP，此基因表達的重組蛋 白疫苗及含HGFSP基因的重組痘苗活疫苗可誘導HGFSP特異性抗體生 成，免疫血清可抑制體外培養(yǎng)的紅內(nèi)期惡性瘧原蟲的生長。本研究利用 HGFSP與真核表達載體pcDNA3重組，構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒 pc-HGFSP；脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細胞，觀察HGFSP基因體外表 達產(chǎn)物的抗原性；pc-HGFSP質(zhì)粒DNA直接免疫小鼠，觀察其在小鼠肌 肉組織的表達及所誘導的體液和細胞免疫應答；觀察pc-HGFSP免疫血 清對體外生長紅內(nèi)期惡性瘧原蟲的抑制作用。通過探索瘧原蟲DNA免疫 新途徑，為結(jié)合應用HGFSP的重組蛋臼疫茵、DNA疫茵和重組痘苗病 毒疫苗進行抗攻擊試驗奠定基礎(chǔ)。 研究方法：一．重組真核表達質(zhì)粒 P C十GFSP的構(gòu)建及鑒定 1．亞 克隆法構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒 p C爿GFSP；并用酶切鑒定。L脂質(zhì)體 介導法轉(zhuǎn)染肝癌 HCpGZ紉1胞；G4選樣堵養(yǎng)陽性細胞克隆后用問接免 疫熒光試驗門）觀察 HGFSP抗原的表達；SDS。PAGE及 Western blot 鑒定表達產(chǎn)物的抗原性。二．pc十GFSP質(zhì)粒DNA免疫小鼠誘導的免疫應 答1．堿裂解法大量制備pCKGFSP重組質(zhì)粒及pCDNA3載體質(zhì)粒。 2．C57BL歷小鼠隨機分為：①NS對照；②pCDNA3 ＆體質(zhì)粒對照；③ pcKGFSP重組質(zhì)粒組。鹽酸hi比卡因匕 0 u g／ml于左后肢股四頭肌注射 預處理 24h后，于同一部位注射 ling／nl DNA溶液 0、lml，對照組注射等 體積 NS或載體質(zhì)粒，間隔 3周（dZI，d42）各同量加強免疫一次，于末 次加強免疫后 2周（d56）和 4周（d70）取小鼠血清及脾細胞觀察多項 免疫學指標。3．ELIS＾法測定血清抗 IIGFSP－IgG含量：每組 6 ．q眼眶或 割尾取血，1：100稀釋后加入經(jīng) HGFSP抗原包被的 96孔板進行測定。 4．淋巴細胞增殖活性測定：d56、d70取＊5 XIO懺L脾細胞懸液于 96孔 板，每個樣本分4組：①培養(yǎng)液空白對照；②pc－HGFSP實驗組；＠ConA 陽性對照；④轉(zhuǎn)鐵蛋白陰性對照，用MTT ＆測定并計算刺激指數(shù)SI。 5．NK細胞活性測定：實驗設(shè)靶綱胞自發(fā)釋放孔、靶細胞最大釋放孔、一 脾細胞自發(fā)釋放孔及實驗孔（效應細胞＋靶細胞）。脾效應細胞（E）：YACd （T）。25：l及50：l，以 YAC－l為靶細胞用 LDH＆測定并計算NK細 胞活性。6．CTL活性測定：于 d56取腳細胞懸液于 24孔板，加 Con A、 rhIL．2和 HGFSP蛋白抗原培養(yǎng) 5天誘生CTLs，用 HGFSP蛋白抗原處理 的 PSIS靶細胞按 NK活性測定方法測定并計算 CTL活性。7．CD4”、 CDS”T細胞亞群測定：d56、d70取脾細胞按試劑盒的方法用抗CD4及 抗CDS單抗進行，當日用流式細胞儀測定。8．血清一氧化氮（NO）含 2 量測定：d56，d70 t小鼠血清按NO試劑盒的方法進行。9．注射部位肌 肉組織免疫酶檢查：取小鼠注射部位肌肉組織，固定、包埋。切片后進 行。10．脾臟指數(shù)測定：處死動物時稱取小鼠脾臟重量，計算其占體重 的百分比。11．體外抑制試驗；蠟燭缸法培養(yǎng)惡性瘧原蟲，5％山梨醇同 步化處理，加不同濃度pC－HGFSP免疫組小鼠血清，以同濃度pCDNA3 載體質(zhì)粒兔疫組血請為陰性對照，于第24h及72h分取血樣涂片染色鏡 檢，計算原蟲抑制率。 結(jié)果；一，重組真核表達質(zhì)粒P。－HGFSP的構(gòu)建及鑒定1．酶切 電泳結(jié)果顯示，pc－HGFSP可用 Hindlll和 BamHI yRta切切出約 600hp長 的 HGFSP完整基因片段，用 PSt單酶切，可切出約 350hp長的部分基 因片段，說明pc－HGFSP構(gòu)建正確。2．IFA結(jié)果顯示，pC－HGFSP／HepGZ 細胞產(chǎn)生較強的免疫熒光反應，而未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HepGZ細胞無熒光反應。 3．SDS－PAGE及 WestsrS blot結(jié)果顯示，PC－HGFSP／fICpGZ細胞裂解液 中出現(xiàn)一條分子量約23kDa的蛋臼條帶，司”特異性為HGFSP蛋白抗原免 疫血清識別。二．P。－HGFSP質(zhì)粒DNA兔疫小鼠誘導的免疫應答：1．免 疫后三次（d56、d70、d84）ELISA法測定，pC－HGFSP u疫小鼠血清 HGFSP抗原
【學位授予單位】：第一軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2000
【分類號】：R382.31

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2767964