【摘要】：植物口服疫苗，成本低廉，使用簡便，可規(guī)�；a(chǎn)，且具有完整的真核細(xì)胞表達系統(tǒng)；果蔬類植物如番茄、香蕉等以其獨具的可食(飼)性在疫苗研制方面展示了良好的開發(fā)應(yīng)用潛能。目前已有多種疫苗分子在轉(zhuǎn)基因植株中得到表達，部分植物疫苗經(jīng)動物實驗和志愿者的口服免疫測試結(jié)果表明：其可有效激發(fā)機體產(chǎn)生特異性的局部粘膜免疫反應(yīng)和全身體液免疫、細(xì)胞免疫反應(yīng)。 弓形蟲：呈世界性分布，宿主廣泛，人群感染率高，危害嚴(yán)重，尤其對孕婦、兒童和免疫力低下人群以及畜牧業(yè)生產(chǎn)均構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，弓形蟲感染與弓形蟲病最好的防治手段是能研制出價廉易用的疫苗。植物基因工程的發(fā)展給弓形蟲疫苗研制帶來新的思路。 本研究利用自行克隆鑒定的番茄果實特異性E8啟動子，以及植物組成型啟動子E35S，驅(qū)動優(yōu)勢弓形蟲疫苗候選分子MAG和tSAG1，轉(zhuǎn)化番茄，篩選鑒定獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株，并進行轉(zhuǎn)化植株T1代初步的遺傳分析，期望獲得值得進一步深入研究的能高效穩(wěn)定表達MAG和tSAG1的番茄轉(zhuǎn)化株系，為研制弓形蟲轉(zhuǎn)基因番茄口服疫苗，探索弓形蟲感染和弓形蟲病的有效防治途徑，奠定工作基礎(chǔ)。 Ⅰ．番茄果實特異性E8啟動子的基因克隆與序列分析 目的 獲取番茄果實特異性E8啟動子基因，為實現(xiàn)外源基因在轉(zhuǎn)基因番茄中果實特異性表達做準(zhǔn)備。 方法 培養(yǎng)中蔬5號(Zhongshu No.5)番茄幼苗，采集葉片，用Omega公司的植物基因組提取試劑盒提取番茄基因組DNA；設(shè)計引物，從基因組中通過PCR擴增獲得番茄果實特異性E81.1(E8核心啟動子區(qū))和E82.2(E8啟動子全長)基因；克隆進pGEM-T載體，酶切鑒定；送上海基康公司測序；序列分析。 第一軍醫(yī)大學(xué)薄士學(xué)應(yīng)論戈 摘要 結(jié)果 從番茄基因組DNA中PCR擴增得到預(yù)期大小的啟動子片段;構(gòu)建重 組pGEM一T一E81 .1和pGEM一T一E82.2載體，經(jīng)酶切證實具有預(yù)期大小的插 入子片段;測序結(jié)果分析顯示:番茄果實特異性E8啟動子序列高度保守， 所獲得的Zhongshu No.5 E82.2啟動子DNA序列與Deikman J.報道的 eherry種的E82.2啟動子同源性為99%，登陸GENBANK，ID號為 AFS 1 5784。 結(jié)論 成功獲得我國優(yōu)良純種番茄zhongshu No.5果實特異性E81.1、E82.2 啟動子基因，這是我國番茄果實特異性E8啟動子序列的首次報道。 n.弓形蟲MAG植物表達載體的構(gòu)建 目的 將含弓形蟲多個保護性抗原表位的編碼基因即多表位基因(MAG)， 分別用植物組成型啟動子E35S和番茄果實特異性E82.2啟動子以及 E35S一E81.1復(fù)合式雙啟動子驅(qū)動，構(gòu)建MAG植物表達載體。 方法 1將MAG亞克隆進PBAC55載體，構(gòu)建中間載體pB35MG，其以含雙增 強子的花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子(E35S)驅(qū)動MAG，3’端攜帶胭脂 堿合成酶基因終止子(NOS3’)序列，組成E35S/MAG/NOS3’結(jié)構(gòu)單元，經(jīng) 酶切和測序證實后，再將其中E35S/MAG/N 053，結(jié)構(gòu)單元亞克隆進 pCAMBIA2300質(zhì)粒中，構(gòu)建植物表達載體pC35MG。 2用酶切法將番茄果實特異性啟動子E81 .1插入pB35MG載體中，構(gòu) 建含E35S一E81.1復(fù)合式雙啟動子驅(qū)動MAG的中間載體pB35EIMG，再將 其中E35SE81.l/MAG/NOS3’結(jié)構(gòu)單元亞克隆進pCAMBIA23OO質(zhì)粒中，構(gòu)建 植物表達載體pC35EIMG。 3用酶切法將番茄果實特異性啟動子E82.2插入pB35MG載體，構(gòu)建 以E82.2啟動子驅(qū)動MAG的中I’ed載體pBEZMG，再將其中E82.2/MAG/NOS3， 結(jié)構(gòu)單元亞克隆進pCAMBIA2300質(zhì)粒中，構(gòu)建植物表達載體pCEZMG。 男‘葷誣比拿厚士學(xué)游論戈 荷要 4植物表達載體PC35EIMG、pCEZMG中的目的基因MAG序列經(jīng)測序進 行鑒定。 5含三種啟動子驅(qū)動MAG的植物表達載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌乙石火4404 感受態(tài)細(xì)胞后，提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒進行酶切及PCR鑒定。 結(jié)果 重組質(zhì)粒用酶切和PCR鑒定均得到預(yù)期大小片段，琳G中間載體 pB35MG及植物表達載體pC35EIMG、pCEZMG均經(jīng)序列測定確證。 結(jié)論 成功構(gòu)建MAG中間載體pB35MG、pB35EIMG、pBEZMG，以及植物表達 載體pC35MG、pC35EIMG、pCEZMG，并將三種植物表達載體成功導(dǎo)入根癌 農(nóng)桿菌乙石翅4404。 m.弓形蟲tsAGI植物表達載體的構(gòu)建 目的 將優(yōu)勢弓形蟲疫苗分子SAGI基因截短片段(tSAGI)，分別用植物組 成型啟動子E35S和番茄果實特異性E82.2啟動子以及E35S一E81.1復(fù)合 式雙啟動子驅(qū)動，構(gòu)建tSAGI植物表達載體。 方法 1自本室構(gòu)建的pET32a一tSAGI載體中PCR擴增得到tSAGI基因，克 隆進T載體為pMD一T一tSAGI，酶切鑒定后進行測序確認(rèn)。 2用BamHI單酶切連接方式將tSAGI分別亞克隆進pB35MG、 pB35EIMG、 pBEZMG載體，分別構(gòu)建中間載體pB35tSAGI、pB35EltSAGI、 pBEZtSAGI載體。其中，pB35tSAGI以E35S驅(qū)動tSAGI，3，端攜帶NOS3， 終止子序列，組成E35S八SAGI/NOS3’操縱子結(jié)構(gòu)單元。pB35EltSAGI含 E35S一E81.1復(fù)合式雙啟動子驅(qū)動tSAGI，組成E35SE81.l八SAGI/NOS3， 操縱子結(jié)構(gòu)單元。PBEZtSAGI以番茄果實特異性啟動子E82.2驅(qū)動tSAGI， 組成E82.2八SAGI/NOS3，操縱子結(jié)構(gòu)單元。 3 pB35tSAGI、pB35EltSAGI、pBEZtSAGI經(jīng)酶切證實后，分別將其 中E35S八SAGI/NOS3，、E35S一Esl.1八SAGI/NOS3，、E82
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R346
【圖文】：

取的番茄基因組DNA，呈單一條帶，純度高，植物基因組提取試劑盒，提見圖2.1。二、PCR結(jié)果以番茄基因組DNA為模板，P1、P2擴增得到預(yù)期大小的約1.Ikb片段，P3、P2擴增得到預(yù)期大小約2.Zkb片段。見圖2.1、圖2.2。三、印1.1一poEM一T和E82.2一pG〔M一T重組質(zhì)粒的鑒定E81.1一PGEM一T重組質(zhì)粒經(jīng)xbal單酶切后，切出預(yù)期1.Ikb片段;ES1.1一pGEM一T和E82.2一pGEM一T重組質(zhì)粒用Hindlll/BamHI雙酶切后，分別切出了預(yù)期1.Ikb和2.Zkb片段;說明E81.l和E82.2果實特異性啟動子己正確插入PGEM一T載體中。見圖2.3、圖2.4。

茄果實特異性E81.1啟動子基因重組A標(biāo)準(zhǔn)分子量2pGEM一T空載體ApCR產(chǎn)物純化片段4pGEM一T-E81，Ib5，6:pGEM一不Esl.lHindlll+B田舊Hl雙tifieationoftherecombinantPlas而deoh”it·sPeeifieE81，1PromotergenLanelnNAmarkerLaneZPGEM~T從p3PurifiedPCRProduetofEsl.lPromoterT-E81.1尤Kba1Lanes，6PGEM一T-E812345

一、重組質(zhì)粒pMD一T一tSAGI的鑒定以引物Pl、PZ自pET32a一tSAGI擴增獲得預(yù)期700bp的弓形蟲tSAGI基因(圖3.14)。純化后的tSAGI基因克隆進pMD一T載體后，用BamHI單酶切鑒定重組質(zhì)粒，可切出700bp的目的片段(圖3.14);將此重組質(zhì)粒送公司進行序列測定證實序列完全正確。123從圖3.14重組質(zhì)粒pMDesT一tSAGI的酶切鑒定圖質(zhì)粒pMD一TBaJ刀Hl酶切重組質(zhì)粒BalnHI酶切純化的tSAGIPCR產(chǎn)物分子量標(biāo)志物Fig.3.14IdentincationofrecombinantPlas而dpMD一T-tSAGIbyenzymedigestionLane1PMD一TdigestedwithBalllH1Lane2PurifledtSAGIPCRP代心uetLane3ReeombinantPlas而ddigestedwithBalnH1Lane4DNAmarker二、tSAGI中間載體pB35tSAGI、pB35EltSAGI、曲EZtSAGI的鑒定pB35tSAGI、pB35EltSAGI、pBEZtSAGz用BalnHI酶切均可切出預(yù)期大小700bp插入子片段。pB35tSAGI用Xbal單酶切，若正向插入預(yù)期僅切出一線性化大片段，若反向插入則可切出700bP片段;pB35EltsAGI用Xbal單酶切，若正向插入預(yù)期可切出1100bp，反向插入可切出1800bP7l

【參考文獻】

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本文編號：2767622