【摘要】： 目的 干細胞是指具有自我更新能力及多向分化潛能的細胞。雖然胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞、造血干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、皮膚干細胞、胃腸干細胞等相繼發(fā)現(xiàn)，并且造血干細胞已部分應(yīng)用于臨床。但呼吸道中的干細胞尚為推測中的功能細胞，其定位尚未解決。進行支氣管干細胞的定位研究，對闡明支氣管損傷修復的機理、肺癌的組織發(fā)生等有重要的理論意義，而且有自體支氣管重建的實用價值，將來甚至可能形成生物醫(yī)學產(chǎn)業(yè)。 本研究應(yīng)用光鏡、電鏡、AB-PAS染色、免疫組織化學等方法，于原位觀察人支氣管上皮經(jīng)5-FU損傷后的修復過程，從中發(fā)現(xiàn)支氣管干細胞。因干細胞具有不被Rhodamine123染色的特性，并且此特性與細胞表面ATP依賴性外排泵——P-糖蛋白有關(guān)，因此本研究還應(yīng)用流式細胞儀、免疫熒光法、蛋白印跡法、RT-PCR等方法檢測損傷修復過程中Rhodamine123的動態(tài)變化及P-糖蛋白的表達情況，進一步進行支氣管干細胞的性狀解析。 方法 1．支氣管損傷模型的建立取肺癌手術(shù)切除的人支氣管的正常部分進行組織培養(yǎng)。平行于支氣管環(huán)方向?qū)㈦x體人支氣管切成2-3mm寬的組織塊，置于含Ham's F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。實驗組：將支氣管環(huán)置于含5-FU濃度為12.5mg／ml的Ham's F12培養(yǎng)液中，于5％CO_2，37℃二氧化碳孵箱中孵育，12小時后棄去上述培養(yǎng)液，換成新鮮的Ham's F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；于換液培養(yǎng)后0、3、6、12、24、48、72小時分別取出一段組織塊；對照組：應(yīng)用等體積生理鹽水代替5-FU，其余培養(yǎng)條件及取材時間同實驗組。 2．支氣管上皮的損傷修復過程分別應(yīng)用光鏡、電鏡、AB-PAS染色動態(tài)觀察5-FU損傷后的修復過程，用免疫組織化學SP法檢測此過程中PCNA，β_1-整合素及CK-19的表達。 3．Hoechst33342熒光染色 干細胞具有不被Hoechst33342染色的特性。分別取實驗組及對照組支氣管環(huán)，在解剖顯微鏡下機械剝離支氣管上 皮粘膜，涂布于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上，吹干。將Hoechst33342 滴加在支氣管粘膜細胞涂片上，避光37℃孵育30分鐘，PBS洗3次，熒光 顯微鏡觀察。 4.流式細胞儀分析分別取正常組及5一FU作用后的支氣管上皮，用 蛋白酶消化法獲取支氣管上皮細胞懸液，應(yīng)用流式細胞儀分析: l)PI染色，應(yīng)用PI染液一步法，4℃避光孵育30而n，400目濾網(wǎng)過濾， 上流式細胞儀FACSean(Beeton Dieldnson)檢測。經(jīng)CellQuest軟件分析，確 定細胞周期各期細胞百分數(shù); 2)活細胞的助odal址ne123的染色，支氣管上皮細胞懸液內(nèi)加Rhoda- 而ne 123，終濃度為10例擴nil，于37℃孵育30而n，PBS洗2次，再加不含R加- damine123的DMEM培養(yǎng)液37℃避光孵育1小時，PBS洗2次，為排除壞死 細胞的干擾，加PI工作液，終濃度為2林歲而，染色5而n后立刻經(jīng)流式細胞 儀檢測。動態(tài)觀察損傷修復過程中Rhodaminel23陰性細胞所占比例。 5.P一糖蛋白的表達情況取5一FU作用前后的支氣管上皮，分別應(yīng) 用免疫熒光、流式細胞儀及蛋白印跡法分析P一糖蛋白的表達情況。 6.應(yīng)用RT一PCR法檢測P一糖蛋白mRNA的表達，使用Trizol提取5 一FU處理前后人支氣管上皮總RNA，引物序列如下:MDRI一FS’一CCC ATC Al，r GCA ATA GCA GG一3’MDRI一RS’一CTT CAA ACT TCT GCT CCT GA一3’擴增產(chǎn)物為167坤，Takala一步法RT一PCR試劑盒檢測，擴增 產(chǎn)物進行2%瓊脂糖電泳，相同條件下，用p一actin作為內(nèi)對照，擴增產(chǎn)物 為69obp，以Kodak1D型凝膠自動成像分析系統(tǒng)拍照。 結(jié)果 1 .5一FU作用12小時后，人支氣管上皮細胞絕大部分脫落，僅見少量 間隔分布的類似裸核的細胞呈釘狀位于基底膜上，PCNA染色陰性，證明為 G0期細胞。其中部分細胞Hoechat33342染色陰性。 2.將5一FU去除3一6小時后，細胞形態(tài)變?yōu)楸馄剑琍CNA染色見核染 色陽性的細胞與陰性細胞(G。期細胞)間隔分布;24小時后細胞變?yōu)榱⒎剑?細胞數(shù)目逐漸增多;到48一72小時恢復假復層柱狀上皮。 3.p;一整合素及CK一19在已分化細胞中呈陽性反應(yīng)。 4.透射電鏡結(jié)果:5一FU作用12小時后人支氣管上皮細胞核大，核漿 比例增大，細胞器少，未見粘液顆粒。 5.細胞周期分析結(jié)果:正常支氣管上皮細胞中G0/G;期細胞占活細胞 的86.54士4.50%;5一FU處理后壞死及凋亡細胞占13.62土4.90%，S+ GZ/M期細胞明顯減少，G0/G;期細胞占活細胞比例增多，占93.33土 4 .95%。 6.正常對照組Rhada而ne123陰性細胞占活細胞的10.46士2.17%，5- FU作用后支氣管上皮Rhodaminel23陰性細胞占活細胞比例增加，為17 .82 土3.16%，差異有顯著意義。 7.應(yīng)用免疫熒光法可見:5一FU作用后的支氣管上皮細胞涂片上有P 一糖蛋白的表達;流式細胞儀分析:正常人支氣管上皮中P一糖蛋白陽性細 胞數(shù)占12.34土1.71%，5一F’U作用后的支氣管上皮P一糖蛋白陽性細胞增 加，占17.54士1.41%;蛋白印跡法提示:5一FU作用后的支氣管上皮較正 常人支氣管上皮P一糖蛋白表達量增加。RT一PCR法提示:5一FU作用后 的支氣管上皮較正常組P一糖蛋白mRNA的表達也有增加趨勢。 結(jié)論 1.本研究首次應(yīng)用5一FU作為損傷因
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R361
【圖文】：

一FU作用12小時后，光鏡下可見支氣管上皮細胞絕大部分脫落，暴露出基底膜，僅剩余少數(shù)較分散的間隔分布的近于裸核的細胞，呈釘狀位于基底膜上(圖1)，PCNA染色陰性，提示為G0期細胞。5一FU作用時間越長，支氣管上皮損傷越重，作用24小時可造成支氣管上皮細胞全部脫落，基底膜也被破壞。因此，以下實驗均采用5一FU作用12小時作為損傷標準。2.5一四損傷后修復過程:5一FU作用12小時后將5一FU去除，換液培養(yǎng)

2.5一四損傷后修復過程:5一FU作用12小時后將5一FU去除，換液培養(yǎng)，觀察支氣管上皮的恢復。換液后3一6小時，支氣管基底膜上可見少量扁平樣細胞，細胞漿有延伸趨勢(圖2，3)。免疫組化染色發(fā)現(xiàn):每高倍視野中支氣管上皮上只有數(shù)個散在間隔分布的PCNA陰性細胞，即在多個陽性細胞之中有一個陰性細胞存在(圖4，6)。換液后24小時基底膜上細胞數(shù)目增加，并逐漸分化呈立方狀，連接成片(圖5)，48一72小時支氣管上皮恢復假復層柱狀上皮，并可見纖毛細胞(圖7)。3.對照組培養(yǎng)過程中支氣管上皮細胞纖毛排列整齊，細胞無脫落。4.Hoechst33342染色:5一FU作用12小時后

損傷組換液6小時后，上皮細胞呈扁平狀，細胞漿互相連接HEx400

【共引文獻】

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本文編號：2767488