【摘要】： 目的 干細(xì)胞是指具有自我更新能力及多向分化潛能的細(xì)胞。雖然胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、胃腸干細(xì)胞等相繼發(fā)現(xiàn)，并且造血干細(xì)胞已部分應(yīng)用于臨床。但呼吸道中的干細(xì)胞尚為推測(cè)中的功能細(xì)胞，其定位尚未解決。進(jìn)行支氣管干細(xì)胞的定位研究，對(duì)闡明支氣管損傷修復(fù)的機(jī)理、肺癌的組織發(fā)生等有重要的理論意義，而且有自體支氣管重建的實(shí)用價(jià)值，將來甚至可能形成生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)。 本研究應(yīng)用光鏡、電鏡、AB-PAS染色、免疫組織化學(xué)等方法，于原位觀察人支氣管上皮經(jīng)5-FU損傷后的修復(fù)過程，從中發(fā)現(xiàn)支氣管干細(xì)胞。因干細(xì)胞具有不被Rhodamine123染色的特性，并且此特性與細(xì)胞表面ATP依賴性外排泵——P-糖蛋白有關(guān)，因此本研究還應(yīng)用流式細(xì)胞儀、免疫熒光法、蛋白印跡法、RT-PCR等方法檢測(cè)損傷修復(fù)過程中Rhodamine123的動(dòng)態(tài)變化及P-糖蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步進(jìn)行支氣管干細(xì)胞的性狀解析。 方法 1．支氣管損傷模型的建立取肺癌手術(shù)切除的人支氣管的正常部分進(jìn)行組織培養(yǎng)。平行于支氣管環(huán)方向?qū)㈦x體人支氣管切成2-3mm寬的組織塊，置于含Ham's F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。實(shí)驗(yàn)組：將支氣管環(huán)置于含5-FU濃度為12.5mg／ml的Ham's F12培養(yǎng)液中，于5％CO_2，37℃二氧化碳孵箱中孵育，12小時(shí)后棄去上述培養(yǎng)液，換成新鮮的Ham's F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；于換液培養(yǎng)后0、3、6、12、24、48、72小時(shí)分別取出一段組織塊；對(duì)照組：應(yīng)用等體積生理鹽水代替5-FU，其余培養(yǎng)條件及取材時(shí)間同實(shí)驗(yàn)組。 2．支氣管上皮的損傷修復(fù)過程分別應(yīng)用光鏡、電鏡、AB-PAS染色動(dòng)態(tài)觀察5-FU損傷后的修復(fù)過程，用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)此過程中PCNA，β_1-整合素及CK-19的表達(dá)。 3．Hoechst33342熒光染色 干細(xì)胞具有不被Hoechst33342染色的特性。分別取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組支氣管環(huán)，在解剖顯微鏡下機(jī)械剝離支氣管上 皮粘膜，涂布于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上，吹干。將Hoechst33342 滴加在支氣管粘膜細(xì)胞涂片上，避光37℃孵育30分鐘，PBS洗3次，熒光 顯微鏡觀察。 4.流式細(xì)胞儀分析分別取正常組及5一FU作用后的支氣管上皮，用 蛋白酶消化法獲取支氣管上皮細(xì)胞懸液，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析: l)PI染色，應(yīng)用PI染液一步法，4℃避光孵育30而n，400目濾網(wǎng)過濾， 上流式細(xì)胞儀FACSean(Beeton Dieldnson)檢測(cè)。經(jīng)CellQuest軟件分析，確 定細(xì)胞周期各期細(xì)胞百分?jǐn)?shù); 2)活細(xì)胞的助odal址ne123的染色，支氣管上皮細(xì)胞懸液內(nèi)加Rhoda- 而ne 123，終濃度為10例擴(kuò)nil，于37℃孵育30而n，PBS洗2次，再加不含R加- damine123的DMEM培養(yǎng)液37℃避光孵育1小時(shí)，PBS洗2次，為排除壞死 細(xì)胞的干擾，加PI工作液，終濃度為2林歲而，染色5而n后立刻經(jīng)流式細(xì)胞 儀檢測(cè)。動(dòng)態(tài)觀察損傷修復(fù)過程中Rhodaminel23陰性細(xì)胞所占比例。 5.P一糖蛋白的表達(dá)情況取5一FU作用前后的支氣管上皮，分別應(yīng) 用免疫熒光、流式細(xì)胞儀及蛋白印跡法分析P一糖蛋白的表達(dá)情況。 6.應(yīng)用RT一PCR法檢測(cè)P一糖蛋白mRNA的表達(dá)，使用Trizol提取5 一FU處理前后人支氣管上皮總RNA，引物序列如下:MDRI一FS’一CCC ATC Al，r GCA ATA GCA GG一3’MDRI一RS’一CTT CAA ACT TCT GCT CCT GA一3’擴(kuò)增產(chǎn)物為167坤，Takala一步法RT一PCR試劑盒檢測(cè)，擴(kuò)增 產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖電泳，相同條件下，用p一actin作為內(nèi)對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物 為69obp，以Kodak1D型凝膠自動(dòng)成像分析系統(tǒng)拍照。 結(jié)果 1 .5一FU作用12小時(shí)后，人支氣管上皮細(xì)胞絕大部分脫落，僅見少量 間隔分布的類似裸核的細(xì)胞呈釘狀位于基底膜上，PCNA染色陰性，證明為 G0期細(xì)胞。其中部分細(xì)胞Hoechat33342染色陰性。 2.將5一FU去除3一6小時(shí)后，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)楸馄�，PCNA染色見核染 色陽性的細(xì)胞與陰性細(xì)胞(G。期細(xì)胞)間隔分布;24小時(shí)后細(xì)胞變?yōu)榱⒎剑?細(xì)胞數(shù)目逐漸增多;到48一72小時(shí)恢復(fù)假?gòu)?fù)層柱狀上皮。 3.p;一整合素及CK一19在已分化細(xì)胞中呈陽性反應(yīng)。 4.透射電鏡結(jié)果:5一FU作用12小時(shí)后人支氣管上皮細(xì)胞核大，核漿 比例增大，細(xì)胞器少，未見粘液顆粒。 5.細(xì)胞周期分析結(jié)果:正常支氣管上皮細(xì)胞中G0/G;期細(xì)胞占活細(xì)胞 的86.54士4.50%;5一FU處理后壞死及凋亡細(xì)胞占13.62土4.90%，S+ GZ/M期細(xì)胞明顯減少，G0/G;期細(xì)胞占活細(xì)胞比例增多，占93.33土 4 .95%。 6.正常對(duì)照組Rhada而ne123陰性細(xì)胞占活細(xì)胞的10.46士2.17%，5- FU作用后支氣管上皮Rhodaminel23陰性細(xì)胞占活細(xì)胞比例增加，為17 .82 土3.16%，差異有顯著意義。 7.應(yīng)用免疫熒光法可見:5一FU作用后的支氣管上皮細(xì)胞涂片上有P 一糖蛋白的表達(dá);流式細(xì)胞儀分析:正常人支氣管上皮中P一糖蛋白陽性細(xì) 胞數(shù)占12.34土1.71%，5一F’U作用后的支氣管上皮P一糖蛋白陽性細(xì)胞增 加，占17.54士1.41%;蛋白印跡法提示:5一FU作用后的支氣管上皮較正 常人支氣管上皮P一糖蛋白表達(dá)量增加。RT一PCR法提示:5一FU作用后 的支氣管上皮較正常組P一糖蛋白mRNA的表達(dá)也有增加趨勢(shì)。 結(jié)論 1.本研究首次應(yīng)用5一FU作為損傷因
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R361
【圖文】：

一FU作用12小時(shí)后，光鏡下可見支氣管上皮細(xì)胞絕大部分脫落，暴露出基底膜，僅剩余少數(shù)較分散的間隔分布的近于裸核的細(xì)胞，呈釘狀位于基底膜上(圖1)，PCNA染色陰性，提示為G0期細(xì)胞。5一FU作用時(shí)間越長(zhǎng)，支氣管上皮損傷越重，作用24小時(shí)可造成支氣管上皮細(xì)胞全部脫落，基底膜也被破壞。因此，以下實(shí)驗(yàn)均采用5一FU作用12小時(shí)作為損傷標(biāo)準(zhǔn)。2.5一四損傷后修復(fù)過程:5一FU作用12小時(shí)后將5一FU去除，換液培養(yǎng)

2.5一四損傷后修復(fù)過程:5一FU作用12小時(shí)后將5一FU去除，換液培養(yǎng)，觀察支氣管上皮的恢復(fù)。換液后3一6小時(shí)，支氣管基底膜上可見少量扁平樣細(xì)胞，細(xì)胞漿有延伸趨勢(shì)(圖2，3)。免疫組化染色發(fā)現(xiàn):每高倍視野中支氣管上皮上只有數(shù)個(gè)散在間隔分布的PCNA陰性細(xì)胞，即在多個(gè)陽性細(xì)胞之中有一個(gè)陰性細(xì)胞存在(圖4，6)。換液后24小時(shí)基底膜上細(xì)胞數(shù)目增加，并逐漸分化呈立方狀，連接成片(圖5)，48一72小時(shí)支氣管上皮恢復(fù)假?gòu)?fù)層柱狀上皮，并可見纖毛細(xì)胞(圖7)。3.對(duì)照組培養(yǎng)過程中支氣管上皮細(xì)胞纖毛排列整齊，細(xì)胞無脫落。4.Hoechst33342染色:5一FU作用12小時(shí)后

損傷組換液6小時(shí)后，上皮細(xì)胞呈扁平狀，細(xì)胞漿互相連接HEx400

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2767488