【摘要】：抗腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體能夠中和高濃度TNF-α在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的各種有害效應(yīng)，阻止其引起的如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展，在治療多種相關(guān)疾病方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。已有許多實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，具有中和作用的抗TNF-α單克隆抗體能夠預(yù)防和治療因TNF-α過量而導(dǎo)致的炎癥、感染性休克等相關(guān)疾病狀態(tài)。我們利用噬菌體表面展示技術(shù)制備基因工程抗TNF-α單鏈抗體(scFv)，一方面建立了在體外大量制備抗體的簡(jiǎn)便的生產(chǎn)工藝，解決了目前TNF-α單抗制備工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低的問題；另一方面由于scFv只含有抗體的重鏈可變區(qū)(VH )和輕鏈可變區(qū)(VL)片段，具有分子量小、免疫原性低、穿透力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，克服了鼠源性單抗免疫原性強(qiáng)、分子量大、不易穿過血管壁的缺陷，使得抗TNF-α scFv在臨床免疫治療中具有良好的應(yīng)用前景；第三，由于噬菌體展示技術(shù)實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)表型和基因型的統(tǒng)一，使得該體系成為探索和分析蛋白質(zhì)相互識(shí)別規(guī)律的一種極有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)工具。 本研究內(nèi)容包括抗TNF-α噬菌體scFv抗體文庫的構(gòu)建，從中篩選、鑒定抗TNF-α scFv，用基因工程方法提高其表達(dá)量并進(jìn)行人源化改造等工作，并對(duì)scFv重鏈可變區(qū)一級(jí)結(jié)構(gòu)的保守性進(jìn)行了初步分析。 I 構(gòu)建抗TNF-α噬菌體抗體scFv文庫 為了得到抗TNF-α scFv，我們首先構(gòu)建了小鼠噬菌體單鏈抗體庫。用rhTNF-α免疫小鼠后，間接ELISA方法測(cè)定免疫小鼠血清的抗體效價(jià)。結(jié)果表明其中兩只小鼠的抗體效價(jià)介于10-5-10-6之間，符合構(gòu)建抗體庫的要求。分離免疫小鼠的脾細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，用重疊延伸PCR方法擴(kuò)增得到scFv基因。此過程包括：①利用針對(duì)抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的引物分別擴(kuò)增VH 和VL基因片段，將兩種PCR產(chǎn) WP=7 物進(jìn)行純化并測(cè)定濃度。②再用含Linker的引物將VH 和VL基因片段通過Linker連接起來形成scFv。③最后用含有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增scFv，在scFv的5’端和3’端分別加上Sfi I和Not I酶切位點(diǎn)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增的VH和VL基因片段的長度分別是360和330 bp左右，scFv基因片段的長度大約是750 bp。將scFv擴(kuò)增片段純化后，分別用Sfi I和Not I進(jìn)行酶切，并與線性化噬粒pCANTAB 5 E體外連接。經(jīng)限制酶酶切鑒定證實(shí)scFv片段以Sfi I/Not I位點(diǎn)定向插入噬粒的gpIII基因前方，將連接產(chǎn)物命名為pATF。用CaCl2法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli TG1，制備細(xì)菌形式的噬菌體單鏈抗體庫，增加轉(zhuǎn)化次數(shù)以提高抗體庫的容量。通過菌落計(jì)數(shù)得到該抗體庫的容量大約是4.6(106，大小中等。限制性酶切分析抗體庫的重組率為83%。 II 篩選抗TNF-α scFv陽性克隆及其鑒定 我們利用rhTNF-α對(duì)抗體庫進(jìn)行篩選以得到TNF-α特異性噬菌體克隆。首先用rhTNF-α對(duì)抗體庫進(jìn)行3輪淘洗。用輔助噬菌體M13KO7感染轉(zhuǎn)化菌，以挽救出噬菌體形式的抗體庫。將此抗體庫加入用rhTNF-α包被的酶標(biāo)板內(nèi)，孵育一段時(shí)間后洗滌，能夠與抗原特異結(jié)合的scFv噬菌體克隆將被保留在孔內(nèi)，然后用pH 2.2的Tris將結(jié)合的噬菌體洗脫下來，感染對(duì)數(shù)生長期E.coli TG1，以擴(kuò)增抗原特異性噬菌體克隆。重復(fù)上述操作兩次。這樣，經(jīng)過三輪“吸附－洗脫－擴(kuò)增”的淘洗過程，抗體庫中與TNF-α特異性結(jié)合的噬菌體克隆從第一輪后的3.5(104 pfu增加至第三輪后的6.0(108 pfu，被富集了17 000倍。Dot blot檢測(cè)也顯示了明確的富集效果。隨機(jī)挑取40個(gè)克隆，用M13KO7感染后使scFv表達(dá)于噬菌體表面，ELISA篩選呈現(xiàn)有抗TNF-α scFv的噬菌體克隆。檢測(cè)結(jié)果表明，有3個(gè)克隆的A490值最高，對(duì)這3個(gè)克隆重復(fù)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)均具有特異性抗原結(jié)合活性，而且與其它抗原沒有交叉反應(yīng)。其中有1個(gè)克隆(B18)結(jié)合抗原的靈敏度最高，因此選擇該克隆作進(jìn)一步研究分析。 III 抗TNF-α scFv的可溶性表達(dá)及鑒定 在噬粒結(jié)構(gòu)基因中，位于scFv和gpIII基因之間有一個(gè)琥珀終止密碼 WP=8 子(TAG)，當(dāng)噬粒在抑制性E.coli TG1中表達(dá)時(shí)，TAG被通讀而不起終止密碼子的作用，scFv與gpIII以融合形式表達(dá)并展現(xiàn)于噬菌體顆粒表面。而在非抑制性E.coli HB2151中，TAG被識(shí)別為終止密碼子，scFv以可溶性方式分泌至細(xì)菌胞周質(zhì)中。我們將篩選得到的抗TNF-α噬菌體陽性克隆感染E.coli HB2151，建立抗TNF-α scFv可溶性表達(dá)體系并對(duì)其進(jìn)行活性檢測(cè)。 將陽性克隆感染E.coli HB2151，30(C、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)20 h，分別制備胞周質(zhì)、培養(yǎng)基上清和全細(xì)胞提取物。經(jīng)12% SDS-PAGE和Western blot分析，目的蛋白相對(duì)分子量為32(103，濃集于胞周質(zhì)中，表達(dá)量占全菌總蛋白1%左右，將此可溶形式的抗TNF-α scFv命名為s-B18。用抗E-tag抗體親和層析方法純化位于胞周質(zhì)中的s-B18，純化后s-B18的回收率為0.3%，產(chǎn)量為3.3 mg/L。 s-B18的活性測(cè)定采用以下方法：①競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定s-B18與TNF-α的親和常數(shù)；②競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)s-B18對(duì)抗TNF-α IgG與TNF-α結(jié)合的抑制作用；③檢測(cè)s-B18對(duì)TNF-α致L929細(xì)胞毒的中和作用；④Dot blot鑒定s-B18識(shí)別TNF-α表位的情況。結(jié)果表明，s-B18與TNF-α的親和常數(shù)約為8(107 M-1，能夠抑制抗TNF-α IgG與TNF-α的結(jié)合，且可以中和TNF-α對(duì)L929細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用，IC50為70 (g/ml。s-B18能夠識(shí)別TNF
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R392.1
【圖文】：

因片段的擴(kuò)增 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后，以 cDNA 第一鏈為模CR 擴(kuò)增出 VH基因；以 Light Primer Mix 增產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，并與因片段約為 360 bp，VL基因片段約為 330計(jì)的 VH和 VL基因大小相符，結(jié)果見圖 純化產(chǎn)物經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定，VH和1 μg/ml(表 2)。1-2: 3,4 號(hào)小鼠脾淋巴細(xì)胞的總 RNA1 2 3 4 5 6 7 bp

圖 4 scFv 純化產(chǎn)物的 1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖1: scFv 純化產(chǎn)物; 2: DL 2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)圖5 噬粒pCANTAB 5 E的結(jié)構(gòu)示意圖示意圖說明VH-Linker-VL插入?

山西醫(yī)體庫容量的測(cè)定抗體庫容量，一共進(jìn)行了三次連接和轉(zhuǎn)體庫。經(jīng)計(jì)數(shù)，三次轉(zhuǎn)化后，長出的克隆06，載體自連組長出約 150 個(gè)菌落，而以未板則沒有克隆長出。F 重組率的測(cè)定6 個(gè)轉(zhuǎn)化菌克隆并提取其質(zhì)粒，經(jīng) Sfi I 和 Nv 基因片段插入情況，電泳后與 DNA 分子量放出 750 和 4500 bp 左右的 DNA 片段，其1 2 3 4 5 6 7 8 bp

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 費(fèi)小雯;周玉嬌;鄧曉東;;腫瘤壞死因子α單鏈抗體基因的優(yōu)化及衣藻葉綠體表達(dá)載體的構(gòu)建[J];熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年11期

本文編號(hào)：2767185