【摘要】：心血管系統(tǒng)的發(fā)育、生理、病理等一系列過程主要由構成心血管系統(tǒng)基因組的20，900-27，160個基因控制(劉宗正教授，個人交流)。克隆與鑒定心血管系統(tǒng)疾病相關基因不但對我們了解心血管系統(tǒng)的發(fā)育及生理、病理機制具有重要意義，并可為臨床心血管疾病的治療提供基礎。 伴隨人類基因組計劃發(fā)展起來的生物信息學給尋找、研究心血管系統(tǒng)的重要功能和／或疾病相關基因帶來了新的契機。本研究在構建成人心臟cDNA文庫并進行新ESTs(expressed sequence tags)分離的基礎上，綜合數(shù)據(jù)庫及生物信息學分析，克隆出某些與心血管系統(tǒng)疾病相關的基因，并進一步進行功能鑒定。本文介紹其中兩條新全長cDNA，即心肌特異的蛋白激酶p93和肌組織特異的細胞骨架調(diào)節(jié)蛋白NELIN,現(xiàn)將主要研究結果概述如下： 一、我們在1p31-p21的房室間隔缺損區(qū)克隆到一新的蛋白激酶基因(GenBankac．AF116826)，該基因cDNA全長約3420bp，含一個2505bp的完整閱讀框，可編碼835個氨基酸分子量約為93kD的蛋白質(zhì)，故將其命名為p93。結構域分析表明p93含三種結構域：N端為7個錨蛋白重復(ankyrin repeats)結構域，中間為一激酶結構域，C末端為富含絲氨酸結構域。同源性分析提示p93為整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)的遠源同源基因。種系發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)p93與ILK等可能同屬MAPKKKs家族成員。 用胎兒6種組織、成人8種組織的Northern Blot(Clontech)結果表明，p93僅只在胎兒和成人心臟表達一全長約3.42kb的轉錄本，而其它組織未見表達。經(jīng)76種組織的多組織點陣膜(Clontech MTE)雜交也證實，p93僅在成人及胎兒的心臟表達。在成人心臟各個部位的表達有以下特點：室間膈、心尖最強，右心房及右心室次之，左心室較弱，左心房最弱，其它各種組織未見表達。說明p93確為心臟特異表達的基因。 用核酸免疫法制備了兔抗p93的多克隆抗體，其抗體效價及特異性經(jīng)原核表達的蛋白進行了檢測。心肌免疫組化結果顯示，p93主要在成人與胎兒心肌細胞核內(nèi)表達，胞漿也有少量表達，心肌內(nèi)的血管平滑肌和內(nèi)皮細胞呈陰性。 用重疊延伸點突變PCR法構建p93(K490R)突變體，并對真核表達的p93及其突變體進行了激酶活性體外分析。結果顯示，僅野生型p93能自我磷酸化，而突變體及空載體未顯示相應的磷酸化蛋白條帶。 以C-端(第716-833aa)為誘餌，經(jīng)酵母雙雜交篩選預轉化的心臟cDNA文庫，結果發(fā)現(xiàn)p93能與下列三類蛋白發(fā)生相互作用：①屬肌小節(jié)蛋白的cTnI、MyBP-C、
【學位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2002
【分類號】：R346
【圖文】：

為克隆心血管系統(tǒng)重要功能基因，我們構建了成人心臟的DcNA文庫，并在新ESTs分離基礎上，結合生物信息學分析，克隆了兩個可能與結構性心臟病和心臟發(fā)育有關的新基因夕刃、八乞Z，NI并對p93進行了功能鑒定。圖1是本文的研究策略。

.1.重組腺病毒制備、純化利用pAdEasy系統(tǒng)產(chǎn)生重組腺病毒技術線路見圖3〔44]:9.1.1將目的基因p93克隆入pAdEasy轉移載體.考慮到將來細胞功能實驗時，為使p93蛋白的表達最高，設計引物，使讀碼框的第一個起始密碼AGT周圍序列為叢衛(wèi)AT巡，符合Kozak序列:即一3位是A，+4位是G。以PcNDA4一p93為模板，用高保真的puf酶將基因的整個讀碼框亞克隆入pUC18，序列經(jīng)測序準確無誤后，再用人》刀工和Hz’nd工H雙酶切將其亞克隆至腺病毒穿梭載體pAdTraek一CMV。PCR擴增條件如下:94Co4min:94℃455，55Colmin

所以本研究所克隆的p93的第四外顯子應該還缺3obp�；冖佗诳紤]，即p93的5’UTR還缺約36Obp，恰好相當于三個外顯子長度，所以p93應該有28個外顯子。p93的定位見圖5。2)轉錄起始位點、啟動子區(qū)及上游調(diào)控序列在p93上游確實發(fā)現(xiàn)了負責調(diào)控心臟特異基因表達的轉錄因子GATA結合位點鬧。然而由于生物體有一套基于外顯子(而非內(nèi)含子)的剪切機制，以至于外顯子的長度即使在不同種屬間(例如線蟲和果蠅)也比較保守，但內(nèi)含子的長度變異較大。而且由于真核生物的基因，其調(diào)控序列跨度較大，所以p93真正的起始位點及其啟動子區(qū)比較難以估計。所以研究刀刃轉錄調(diào)控機制還有待實驗的進一步研究。

【共引文獻】

相關期刊論文 前10條

1 易紹東,孟素榮,崔英凱,陳哲明,彭健;中國人Brugada綜合征SCN5A基因突變K317N的定點誘變及其載體構建[J];第一軍醫(yī)大學學報;2003年11期

2 王斌;饒莉;張林;周斌;王宇平;陳新云;;擴張型心肌病與Desmin及血小板活化因子乙酰水解酶基因相關性研究[J];四川大學學報(醫(yī)學版);2006年03期

3 王宇平;肥厚型心肌病的病因學認識及研究進展[J];華西醫(yī)學;2004年01期

4 吳格如 ,姚艷;家族性擴張型心肌病的分子遺傳學特點[J];世界最新醫(yī)學信息文摘;2002年01期

5 劉劍,田野,孟繁超;X-連鎖擴張型心肌病患者杜興氏肌營養(yǎng)不良基因突變分析及臨床評價[J];中國實用內(nèi)科雜志;2004年01期

6 高磊;何國平;;擴張型心肌病相關基因的研究與進展[J];中國臨床康復;2006年44期

7 陳哲明;Brugada綜合征研究進展[J];心臟雜志;2002年03期

8 陳航,饒莉,閆亞非,陳守春;特發(fā)性擴張型心肌病與δ-肌聚糖基因相關性研究[J];中國心血管雜志;2003年03期

9 程寬;王齊兵;陳灝珠;;家族性擴張型心肌病研究進展[J];心血管病學進展;2006年04期

10 周琳;饒莉;;ZASP基因與擴張型心肌病[J];心血管病學進展;2008年02期

相關博士學位論文 前6條

1 陳相健;病毒性心肌炎向擴張型心肌病轉化的分子細胞機制及藥物干預研究[D];南京醫(yī)科大學;2001年

2 吳恒芳;肥厚型心肌病發(fā)病與心肌肌鈣蛋白IArg145Trp突變研究[D];南京醫(yī)科大學;2005年

3 程寬;擴張型心肌病的臨床和預后分析及其與肥厚型心肌病的侯選基因突變篩查研究[D];復旦大學;2006年

4 胡正茂;擴張型心肌病家系致病基因克隆及精神分裂癥易感基因定位研究[D];中南大學;2007年

5 劉金秋;KCNJ5基因Gly387Arg突變導致家族性長QT綜合征[D];大連醫(yī)科大學;2008年

6 趙新然;擴張型心肌病心律失常分析及鈉離子通道SCN5A基因單核苷酸多態(tài)性研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2007年

相關碩士學位論文 前10條

1 陳航;特發(fā)性擴張型心肌病與delta-sarcoglycan基因相關性研究[D];四川大學;2002年

2 陳哲明;Brugada綜合征分子遺傳學研究[D];中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學;2003年

3 陳有仁;心室纖顫自限性機理的實驗研究[D];汕頭大學;2005年

4 王斌;特發(fā)性擴張型心肌病和Desmin基因的相關性研究[D];四川大學;2004年

5 阮發(fā)暉;成年健康體檢人群Brugada心電圖征發(fā)生率的初步調(diào)查及SCN5A基因突變的檢測[D];第一軍醫(yī)大學;2006年

6 呂言;原發(fā)性擴張型心肌病伴慢性收縮性心力衰竭患者血清肌鈣蛋白Ⅰ的改變及臨床意義[D];大連醫(yī)科大學;2007年

7 張蓓蕾;腫瘤壞死因子基因多態(tài)性與擴張性心肌病的相關性研究[D];四川大學;2007年

8 謝燁卿;嗜鉻粒蛋白A在擴張型心肌病中的表達及其與心肌纖維化的關系和機制研究[D];復旦大學;2009年

9 周國忠;15例ARVC/D患者的臨床分析及DSG2基因突變檢測[D];南方醫(yī)科大學;2009年

10 賀慧娟;擴張型心肌病大鼠外周血CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細胞檢測及意義[D];廣西醫(yī)科大學;2010年

本文編號：2765341