【摘要】：心血管系統(tǒng)的發(fā)育、生理、病理等一系列過程主要由構(gòu)成心血管系統(tǒng)基因組的20，900-27，160個(gè)基因控制(劉宗正教授，個(gè)人交流)。克隆與鑒定心血管系統(tǒng)疾病相關(guān)基因不但對我們了解心血管系統(tǒng)的發(fā)育及生理、病理機(jī)制具有重要意義，并可為臨床心血管疾病的治療提供基礎(chǔ)。 伴隨人類基因組計(jì)劃發(fā)展起來的生物信息學(xué)給尋找、研究心血管系統(tǒng)的重要功能和／或疾病相關(guān)基因帶來了新的契機(jī)。本研究在構(gòu)建成人心臟cDNA文庫并進(jìn)行新ESTs(expressed sequence tags)分離的基礎(chǔ)上，綜合數(shù)據(jù)庫及生物信息學(xué)分析，克隆出某些與心血管系統(tǒng)疾病相關(guān)的基因，并進(jìn)一步進(jìn)行功能鑒定。本文介紹其中兩條新全長cDNA，即心肌特異的蛋白激酶p93和肌組織特異的細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白NELIN,現(xiàn)將主要研究結(jié)果概述如下： 一、我們在1p31-p21的房室間隔缺損區(qū)克隆到一新的蛋白激酶基因(GenBankac．AF116826)，該基因cDNA全長約3420bp，含一個(gè)2505bp的完整閱讀框，可編碼835個(gè)氨基酸分子量約為93kD的蛋白質(zhì)，故將其命名為p93。結(jié)構(gòu)域分析表明p93含三種結(jié)構(gòu)域：N端為7個(gè)錨蛋白重復(fù)(ankyrin repeats)結(jié)構(gòu)域，中間為一激酶結(jié)構(gòu)域，C末端為富含絲氨酸結(jié)構(gòu)域。同源性分析提示p93為整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)的遠(yuǎn)源同源基因。種系發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)p93與ILK等可能同屬M(fèi)APKKKs家族成員。 用胎兒6種組織、成人8種組織的Northern Blot(Clontech)結(jié)果表明，p93僅只在胎兒和成人心臟表達(dá)一全長約3.42kb的轉(zhuǎn)錄本，而其它組織未見表達(dá)。經(jīng)76種組織的多組織點(diǎn)陣膜(Clontech MTE)雜交也證實(shí)，p93僅在成人及胎兒的心臟表達(dá)。在成人心臟各個(gè)部位的表達(dá)有以下特點(diǎn)：室間膈、心尖最強(qiáng)，右心房及右心室次之，左心室較弱，左心房最弱，其它各種組織未見表達(dá)。說明p93確為心臟特異表達(dá)的基因。 用核酸免疫法制備了兔抗p93的多克隆抗體，其抗體效價(jià)及特異性經(jīng)原核表達(dá)的蛋白進(jìn)行了檢測。心肌免疫組化結(jié)果顯示，p93主要在成人與胎兒心肌細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，胞漿也有少量表達(dá)，心肌內(nèi)的血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞呈陰性。 用重疊延伸點(diǎn)突變PCR法構(gòu)建p93(K490R)突變體，并對真核表達(dá)的p93及其突變體進(jìn)行了激酶活性體外分析。結(jié)果顯示，僅野生型p93能自我磷酸化，而突變體及空載體未顯示相應(yīng)的磷酸化蛋白條帶。 以C-端(第716-833aa)為誘餌，經(jīng)酵母雙雜交篩選預(yù)轉(zhuǎn)化的心臟cDNA文庫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p93能與下列三類蛋白發(fā)生相互作用：①屬肌小節(jié)蛋白的cTnI、MyBP-C、
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R346
【圖文】：

為克隆心血管系統(tǒng)重要功能基因，我們構(gòu)建了成人心臟的DcNA文庫，并在新ESTs分離基礎(chǔ)上，結(jié)合生物信息學(xué)分析，克隆了兩個(gè)可能與結(jié)構(gòu)性心臟病和心臟發(fā)育有關(guān)的新基因夕刃、八乞Z，NI并對p93進(jìn)行了功能鑒定。圖1是本文的研究策略。

.1.重組腺病毒制備、純化利用pAdEasy系統(tǒng)產(chǎn)生重組腺病毒技術(shù)線路見圖3〔44]:9.1.1將目的基因p93克隆入pAdEasy轉(zhuǎn)移載體.考慮到將來細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)時(shí)，為使p93蛋白的表達(dá)最高，設(shè)計(jì)引物，使讀碼框的第一個(gè)起始密碼AGT周圍序列為叢衛(wèi)AT巡，符合Kozak序列:即一3位是A，+4位是G。以PcNDA4一p93為模板，用高保真的puf酶將基因的整個(gè)讀碼框亞克隆入pUC18，序列經(jīng)測序準(zhǔn)確無誤后，再用人》刀工和Hz’nd工H雙酶切將其亞克隆至腺病毒穿梭載體pAdTraek一CMV。PCR擴(kuò)增條件如下:94Co4min:94℃455，55Colmin

所以本研究所克隆的p93的第四外顯子應(yīng)該還缺3obp�；冖佗诳紤]，即p93的5’UTR還缺約36Obp，恰好相當(dāng)于三個(gè)外顯子長度，所以p93應(yīng)該有28個(gè)外顯子。p93的定位見圖5。2)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、啟動(dòng)子區(qū)及上游調(diào)控序列在p93上游確實(shí)發(fā)現(xiàn)了負(fù)責(zé)調(diào)控心臟特異基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合位點(diǎn)鬧。然而由于生物體有一套基于外顯子(而非內(nèi)含子)的剪切機(jī)制，以至于外顯子的長度即使在不同種屬間(例如線蟲和果蠅)也比較保守，但內(nèi)含子的長度變異較大。而且由于真核生物的基因，其調(diào)控序列跨度較大，所以p93真正的起始位點(diǎn)及其啟動(dòng)子區(qū)比較難以估計(jì)。所以研究刀刃轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制還有待實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究。

【共引文獻(xiàn)】

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1 易紹東,孟素榮,崔英凱,陳哲明,彭健;中國人Brugada綜合征SCN5A基因突變K317N的定點(diǎn)誘變及其載體構(gòu)建[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年11期

2 王斌;饒莉;張林;周斌;王宇平;陳新云;;擴(kuò)張型心肌病與Desmin及血小板活化因子乙酰水解酶基因相關(guān)性研究[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年03期

3 王宇平;肥厚型心肌病的病因?qū)W認(rèn)識(shí)及研究進(jìn)展[J];華西醫(yī)學(xué);2004年01期

4 吳格如 ,姚艷;家族性擴(kuò)張型心肌病的分子遺傳學(xué)特點(diǎn)[J];世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘;2002年01期

5 劉劍,田野,孟繁超;X-連鎖擴(kuò)張型心肌病患者杜興氏肌營養(yǎng)不良基因突變分析及臨床評(píng)價(jià)[J];中國實(shí)用內(nèi)科雜志;2004年01期

6 高磊;何國平;;擴(kuò)張型心肌病相關(guān)基因的研究與進(jìn)展[J];中國臨床康復(fù);2006年44期

7 陳哲明;Brugada綜合征研究進(jìn)展[J];心臟雜志;2002年03期

8 陳航,饒莉,閆亞非,陳守春;特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病與δ-肌聚糖基因相關(guān)性研究[J];中國心血管雜志;2003年03期

9 程寬;王齊兵;陳灝珠;;家族性擴(kuò)張型心肌病研究進(jìn)展[J];心血管病學(xué)進(jìn)展;2006年04期

10 周琳;饒莉;;ZASP基因與擴(kuò)張型心肌病[J];心血管病學(xué)進(jìn)展;2008年02期

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2 吳恒芳;肥厚型心肌病發(fā)病與心肌肌鈣蛋白IArg145Trp突變研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2005年

3 程寬;擴(kuò)張型心肌病的臨床和預(yù)后分析及其與肥厚型心肌病的侯選基因突變篩查研究[D];復(fù)旦大學(xué);2006年

4 胡正茂;擴(kuò)張型心肌病家系致病基因克隆及精神分裂癥易感基因定位研究[D];中南大學(xué);2007年

5 劉金秋;KCNJ5基因Gly387Arg突變導(dǎo)致家族性長QT綜合征[D];大連醫(yī)科大學(xué);2008年

6 趙新然;擴(kuò)張型心肌病心律失常分析及鈉離子通道SCN5A基因單核苷酸多態(tài)性研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

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2 陳哲明;Brugada綜合征分子遺傳學(xué)研究[D];中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué);2003年

3 陳有仁;心室纖顫自限性機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究[D];汕頭大學(xué);2005年

4 王斌;特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病和Desmin基因的相關(guān)性研究[D];四川大學(xué);2004年

5 阮發(fā)暉;成年健康體檢人群Brugada心電圖征發(fā)生率的初步調(diào)查及SCN5A基因突變的檢測[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2006年

6 呂言;原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病伴慢性收縮性心力衰竭患者血清肌鈣蛋白Ⅰ的改變及臨床意義[D];大連醫(yī)科大學(xué);2007年

7 張蓓蕾;腫瘤壞死因子基因多態(tài)性與擴(kuò)張性心肌病的相關(guān)性研究[D];四川大學(xué);2007年

8 謝燁卿;嗜鉻粒蛋白A在擴(kuò)張型心肌病中的表達(dá)及其與心肌纖維化的關(guān)系和機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

9 周國忠;15例ARVC/D患者的臨床分析及DSG2基因突變檢測[D];南方醫(yī)科大學(xué);2009年

10 賀慧娟;擴(kuò)張型心肌病大鼠外周血CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測及意義[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2765341