【摘要】： 人體感染的HPV常見型別分為良性型HPV6、11型和惡性型HPV16、18型等。HPV感染后可導致尖銳濕疣、宮頸上皮內(nèi)瘤和宮頸癌等疾病，特別是惡性型HPV感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。HPV基因組中E區(qū)可分為8個開放讀碼框，分別參與DNA復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、調(diào)控等，E7主要與細胞轉(zhuǎn)化功能及致癌有關(guān)，因此在研究中倍受重視。目前臨床上應用的干擾素等抗病毒治療效果不確切，迫切需要尋找一種有效清除HPV感染以防止尖銳濕疣復發(fā)和宮頸癌的發(fā)生。對E7抗原的CTL表位進行預測，在國內(nèi)外相關(guān)研究基礎上篩選抗原性更強的表位，進行多肽的表位修飾、制備相應的治療性肽疫苗無疑具有重要的臨床意義，本課題就相關(guān)問題作了探索性研究。 E7抗原的CTL表位可以被HLA-A2、HLA-A3分子遞呈，而我國HLA-A2陽性人群高達53%左右，故預測E7抗原的HLA-A2限制性表位具有重要的現(xiàn)實意義。本研究采用超模體方案、多項式方案與量化模體方案等對E7抗原的HLA-A2限制性CTL表位進行預測，綜合考慮預測結(jié)果確定了E7_ 7-15（P1） 、E7_ 11-19（P2）　、E7_ 49-57 （P3）、E7_ 66-74（P4）和E7_ 82-90 （P5）作為合成對象。對已經(jīng)預測出的HLA-A2限制性CTL表位，采用標準Fmoc方案合成多肽，產(chǎn)物經(jīng)RP-HPLC純化、分析，并進行質(zhì)譜分析鑒定。根據(jù)不同九肽疏水性的差異選擇不同的流動相達到了滿意的分離提純效果，RP-HPLC純化后，獲得了純度高于95%的九肽產(chǎn)物，經(jīng)質(zhì)譜測定分子量所得測定值與理論值相符合。高純度的合成肽為表位篩選與鑒定奠定了前提和基礎。對合成、純化和經(jīng)過質(zhì)譜鑒定的多肽，運用敏感性和特異性較高的細胞毒性實驗（LDH釋放法）進行表位鑒定，經(jīng)過特異性殺傷實驗對照研究確定其特異性的抗原作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPV 16 E7_ 11-19（YMLDLQPET）和HPV 16 E7_ 49-57（RAHYNIVTF）屬于HLA-A2限制性CTL表位。實驗結(jié)果對于HPV感染治療性肽疫苗分子設計以及臨床應用試驗奠定了可靠的研究基礎。 在前面對HPV16E7抗原表位的研究中發(fā)現(xiàn)，從理論上分析與HLA-A2結(jié)合力極高的P1、P4和P5，并不具備相應的抗原性。因此，為了解多肽間的相互作用關(guān)系，采 WP=9 用細胞毒實驗（51Cr釋放法）對T2細胞同時包被表位和另外一條多肽的方法，觀察多肽是否影響表位誘導特異性CTL殺傷靶細胞。實驗結(jié)果表明，HPV16E7抗原所包含的多肽序列中，P1、P4和P5與HLA-A2限制性CTL表位P2和P3之間存在明顯的競爭抑制關(guān)系， 其主要原因在表位本身與HLA-A2分子結(jié)合力偏低，當表位與多肽同時包被T2細胞時，其抗原誘導作用明顯受到多肽的影響，因此靶細胞溶破率明顯降低。多肽間的相互競爭抑制作用，可能是HPV感染局部損害反復發(fā)生、病毒難以被機體自發(fā)清除和致癌的重要原因之一，也是進行表位置換修飾的重要依據(jù)。 由于HPV16E7_49-57作為HLA-A2限制性表位雖然能夠誘導特異性CTL殺傷靶細胞，但與HLA-A2的結(jié)合力不高，因此本部分實驗采取置換修飾的方式，以期鑒定出結(jié)合力更高又同時保留原有抗原性的新表位。對置換修飾初步得出的多肽序列運用量化模體法比較其與HLA-A2分子的結(jié)合力，選擇量化積分靠前的多肽，應用計算機分子模擬的方法，從理論上了解多肽與HLA-A2的結(jié)合情況，以確定合成多肽的序列。分子模擬演示的原有表位E7_49-57與另外2條置換多肽的三維結(jié)構(gòu)圖和分子動力學模擬顯示：各肽的羧基末端氨基酸殘基側(cè)鏈都指向HLA-A2.1分子肽結(jié)合槽的F凹槽；第一位氨基酸殘基定位都相同，其側(cè)鏈指向溶液；第二位氨基酸殘基都定位于HLA-A2.1分子肽結(jié)合槽的B凹槽附近；第二位氨基酸殘基的Ca和羧基末端氨基酸殘基的Ca之間距離分別為P3 （E7_ 49-57）17.86 ? 、P① （RLHYNIVTF）17.86 ? 和P⑥ （RLHYNIVTV）17.72 ? 。各九肽進入HLA-A2.1分子肽結(jié)合槽后，都能被肽結(jié)合槽中部所容納。因此，2條修飾多肽可能成為HLA-A2限制性CTL表位，可以進行多肽合成、純化及其鑒定。分子模擬結(jié)果是進一步實驗驗證的重要理論基礎。 經(jīng)過分子模擬初步證實后，根據(jù)標準Fmoc方案采用固相合成法合成多肽，經(jīng)RP-HPLC純化、純度分析，用質(zhì)譜進行定性鑒定。對經(jīng)過合成、純化和鑒定的多肽序列，運用細胞毒實驗（LDH釋放法）鑒定其抗原性，實驗采用包含HPV16E7序列、HLA-A2+的宮頸癌細胞株作為靶細胞，對照肽、P①和P⑥誘導特異性CTL殺傷靶細胞的結(jié)果表明P①具有誘導殺傷作用，P⑥與對照肽無此作用。因此P①可初步確定為HPV16E7抗原HLA-A2限制性新的CTL表位。其置換的氨基酸位于第2位，置換成亮氨酸，置換后第二位氨基酸殘基的Ca和羧基末端氨基酸殘基的Ca之間距離仍然保持不變，為17.86 ?；而同時置換第2位和第9位氨基酸的多肽P⑥， 第二位氨基酸殘基的Ca和羧基末端氨基酸殘基的Ca之間距離縮短為17.72 ?，盡管仍然符合HLA-A2分子限制性表位要求，但對包含HPV16E7序列、HLA-A2+的宮頸癌細胞株沒有誘導 WP=10 殺傷作用，沒能保留原有表位HPV1E7_49-57的抗原性。 表位抗原性可以通過相關(guān)的體外實驗和體內(nèi)實驗來確定。體外實驗初步確定了HPV16E7_49-57及其置換修飾多肽P①的抗原性，后續(xù)實驗通過荷瘤小鼠體內(nèi)實驗，觀察2種多肽在體內(nèi)能否誘導特異性CTLs殺傷靶細胞，進而影響腫瘤的生物學特性，為臨床上?
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R392
【圖文】：

1反相高效液相色譜圖

2反相高效液相色譜圖

3反相高效液相色譜圖

【共引文獻】

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本文編號：2764450