【摘要】：TNF α是炎癥反應(yīng)的一種主要介質(zhì)，在許多疾病的病理過程中起著重要作用，抗TNF α抗體對(duì)這些病理過程能起拮抗作用，從而產(chǎn)生治療效果。在早期工作中，我們?cè)鴱囊恢陠慰寺】贵w雜交瘤克隆出抗TNF α抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因并在大腸桿菌表達(dá)了其單鏈抗體(ScFv)和Fab抗體。為進(jìn)一步提高其親和力，本研究嘗試多種突變方法，利用抗體庫(kù)技術(shù)，建立體外抗體親和力成熟流程，此流程將適用于其它工程抗體。 第一部份：隨機(jī)突變提高噬菌體單鏈抗體的親和力。首先對(duì)pscTNF單鏈抗體基因進(jìn)行兩輪錯(cuò)配PCR，構(gòu)建突變庫(kù)，庫(kù)容為7×10~6。部份克隆測(cè)序顯示堿基突變率為3.7％，氨基酸突變率為10.6％。這些突變有37％分布于CDR區(qū)，63％分布于骨架區(qū)。對(duì)此庫(kù)進(jìn)行四輪淘篩，獲得了多株特異性結(jié)合克隆，有些結(jié)合能力有所提高，但親和力改善不明顯。為觀察這些突變點(diǎn)重組后能否進(jìn)一步提高親和力，我們嘗試了2種技術(shù)路線進(jìn)行基因重組：其一，挑選了7個(gè)活性有所增強(qiáng)的變種克隆進(jìn)行交替延伸PCR(StEP)，使這7個(gè)變種的突變位點(diǎn)交換重組，構(gòu)建變種庫(kù)，經(jīng)篩選和相對(duì)親和力測(cè)定，獲得了兩株(S33和S41)親和力進(jìn)一步提高的克隆。其二，利用DNA交換(DNA shuffling)的方法，對(duì)錯(cuò)配PCR產(chǎn)生的突變進(jìn)行重組交換，構(gòu)建次級(jí)突變庫(kù)，庫(kù)容為1.12×10~7，從中篩選出一株(SP21)親和力明顯提高的抗體變種。第二部份：CDR3突變提高噬菌體抗體親和力。我們嘗試了CDR3部位的限定性突變，選擇Fab噬菌體抗體，采用了兩種策略，一種是在合成引物時(shí)控制每個(gè)位置不同堿基的摻入比率，使親本殘基出現(xiàn)的幾率約為70％；另一種是對(duì)選定的殘基按codon-based突變合成引物，使每個(gè)殘基位置有50％的隨機(jī)突變，其中重鏈CDR3較長(zhǎng)，前后各5個(gè)殘基分別突變，通過重疊延伸PCR的方法分別構(gòu)建輕、重鏈共6個(gè)突變庫(kù)。通過四輪淘篩，經(jīng)測(cè)序和非競(jìng)爭(zhēng)性酶免分析法測(cè)定親合常數(shù)，從輕鏈突變庫(kù)中篩出一株(K8)變種，其親和力提高近28倍。從重鏈突變庫(kù)中挑出10株序列不同的特異性克隆，親和力提高近 摘要 2一65倍。然后將突變的輕鏈基因與突變的重鏈基因組合，以及重鏈CDR3區(qū)前后 不同的突變點(diǎn)之間組合，經(jīng)篩選后獲得親和力進(jìn)一步提高的克隆。我們還嘗試了 CDR3部位的熱點(diǎn)突變，對(duì)單鏈?zhǔn)删w抗體L一CDR3和H一CDR3中的熱點(diǎn)序列進(jìn)行 隨機(jī)突變，構(gòu)建了庫(kù)容為sxlo‘的變種庫(kù)。通過4輪掏篩，得到一株(HOT68) 相對(duì)親和指數(shù)顯著提高的抗體。 本實(shí)驗(yàn)共嘗試比較了5種突變方法。從錯(cuò)配PCR庫(kù)中沒有獲得親和力有明顯 改善的抗體，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過DNA交換和交替延伸PCR使親和力有了較 明顯提高。對(duì)CDR3的突變均得到了親和力提高的克隆，其中CDR3熱點(diǎn)突變只獲 得一株親和力有顯著提高的變種，對(duì)輕重鏈CDR3的限定性突變，獲得了多株親 和力提高的變種，經(jīng)輕重鏈突變的組合后，親和常數(shù)最高提高近93倍�？傮w上 分析，通過合成CDR3限定性突變引物引入突變效果最好，。 本工作得到了親和力提高的抗TNF一a抗體，同時(shí)通過對(duì)不同突變方法的嘗 試比較，初步確定了抗體體外親和力成熟的可行方案，為以后的研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果1致錯(cuò)PCR突變庫(kù)的構(gòu)建及篩選親本抗本基因經(jīng)過兩次致錯(cuò)PCR擴(kuò)增(圖2)，構(gòu)建了噬菌體突變庫(kù)抗體庫(kù)，其庫(kù)容為7X106cfu，重組率為75%。在第四輪篩選后，隨機(jī)挑取78個(gè)克隆制備噬菌體抗體進(jìn)行ELISA檢測(cè)，其中44個(gè)克隆0D怕。信號(hào)高于親本抗體，8個(gè)與親本抗體活性相當(dāng)，26個(gè)低于親本抗體。圖3為部分活性較高克隆的測(cè)定結(jié)果。挑取H個(gè)ELISA檢測(cè)0D值較高的克隆測(cè)序，E25為野生型

其庫(kù)容為7X106cfu，重組率為75%。在第四輪篩選后，隨機(jī)挑取78個(gè)克隆制備噬菌體抗體進(jìn)行ELISA檢測(cè)，其中44個(gè)克隆0D怕。信號(hào)高于親本抗體，8個(gè)與親本抗體活性相當(dāng)，26個(gè)低于親本抗體。圖3為部分活性較高克隆的測(cè)定結(jié)果。挑取H個(gè)ELISA檢測(cè)0D值較高的克隆測(cè)序，E25為野生型，E2與EZ一15相同，E36與E3一11相同，E42與E47相同，最終獲得7個(gè)不同的突變基因序列(見表1)。其中氨基酸突變發(fā)生最少克隆是E42，共有4個(gè)殘基改變(氨基酸殘基按Kabat系統(tǒng)編號(hào)，下同。輕鏈可變區(qū)一個(gè)，K18一E;重鏈可變區(qū)3個(gè)

克隆制備噬菌體抗體，低于親本抗體的克隆，EL工SA檢測(cè)，OD值反映其中32個(gè)高于，4個(gè)相當(dāng)，圖6為部分活性增高克隆的檢測(cè)結(jié)果。對(duì)這21個(gè)行PCR鑒定，結(jié)果均攜帶抗體基因。圖5交替延伸PCR擴(kuò)增單鏈抗體基因電泳圖。M:DNAmarker(DL2000)A:重組的突變基因

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王乃東;袁安文;薛立群;;鏈替換技術(shù)提高噬菌體抗體親和力的研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2010年08期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王乃東;鼠源性高親和力H-Y噬菌體Fab抗體的篩選與早期胚胎性別鑒定[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2763035