【摘要】： 瘧疾是一種在全球范圍內(nèi)嚴重影響人類健康的傳染性疾病。因瘧原蟲和蟲媒對化學藥物及殺蟲劑的耐藥性及抗藥性不斷增加，全球每年有3~5億人感染，近250萬人死亡。導致目前狀況的主要病原體是惡性瘧原蟲。由于其生活周期復雜，抗原具有階段特異性、蟲株差異性和高度變異性等特點，長期以來形成研制抗瘧原蟲疫苗的技術瓶頸。因此，針對惡性瘧原蟲不同生活時期的免疫反應特點，選取誘導產(chǎn)生多種免疫反應類型的不同抗原構建多表位疫苗已經(jīng)成為研究抗瘧疫苗的熱點。但是，目前對多抗原表位疫苗的研究仍然是以人工合成多表位肽疫苗或單一固定的串聯(lián)多表位DNA疫苗為主，前者成本昂貴，后者免疫原性低，難以達到預期的免疫反應多樣性和令人滿意的保護效果。為了解決多表位DNA疫苗的不足之處，我們首次借鑒了分子育種技術(即DNA改組)的隨機重組原理，將其應用到構建多表位DNA疫苗中，建立了一套優(yōu)化多表位人工抗原DNA疫苗的新方法——表位改組(Epitope shuffling)技術。 在本研究中，針對參與抗瘧原蟲紅內(nèi)期感染的免疫反應類型，我們選擇了14個主要來自惡性瘧原蟲紅細胞內(nèi)期的B細胞和Th細胞表位作為研究對象。在摸索表位改組方法的過程中，先后提出并試用了聚合酶鏈式反應組裝技術和同尾酶隨機重組技術，最終以同尾酶隨機重組技術構建了五個不同基因大小的多表位基因抗原庫(依小到大命名為L1、L2、L3、L4和L5)。經(jīng)聚合酶聯(lián)式反應-單鏈構象多態(tài)性分析，表明了所構建的每個基因抗原庫均具有較高的多表位基因隨機組裝多態(tài)性。通過抗原文庫免疫方法，表明了不同多表位基因鏈長度大小的抗原文庫產(chǎn)生了不同程度的免疫反應效果。其中以2.0kb分子量的L4和1.2kb分子量的L3多表位抗原庫在免疫動物后獲得了最好的免疫反應水平，并在隨后用鼠瘧動物模型進行感染攻擊時顯示出交叉保護效果。從而證實了不同多表位人工抗原基因鏈的長度對疫苗免疫原性具有重要的影響。同時，也證明了所構建的多表位抗原庫免疫具有較理想的免疫反應效果，適合從中篩選最佳嵌合的多表位基因。 以抗原庫免疫抗血清的有限稀釋抗體為檢測探針，通過高通量免疫化學篩選方案，分別從L3和L4的原核表達文庫中篩選到三個高免疫源性基因ES312、ES391和ES452。體內(nèi)免疫實驗結果表明了，在相同基因表達水平的情況下，三個多表位基因的抗體反應水平較基因大小相近的其他多表位基因高出100-200倍；而酶聯(lián)免疫吸附和免疫共沉淀實驗證實了其產(chǎn)生的特異抗體具有較高多樣性。在誘發(fā)產(chǎn)生CD4細胞水平上，三個多表位基因亦均表現(xiàn)出較高的免疫誘導能力。在鼠瘧動物模型實驗中，其中多表位基因ES312免疫可獲得100％的交叉保護效果；在對惡性瘧原蟲的體外生長抑制實驗中，細胞流式方法檢測基因ES312的抑制率可高達95.8％�；蛐蛄蟹治鼋Y果進一步表明了，三個高免疫原性基因在表位間組裝方式，及其編碼蛋白的二級結構上均具有一定的共有保守結構。這充分說明了多表位基因間的組裝方式和全蛋白空間結構決定了多表位基因疫苗的免疫原性。 通過多表位人工抗原基因的體內(nèi)免疫實驗，我們證實其中一種人工抗原—ES312—的多表位基因串聯(lián)形式能夠在機體中誘導產(chǎn)生較強的特異性抗體反應，與此同時，在初次免疫后還誘導出以細胞因子IFN-γ為主的Th1細胞反應，在隨后的加強免疫過程中又逐漸誘導出一定水平的Th2細胞反應。最終證實，只有產(chǎn)生這種免疫反應類型的小鼠才能有效地抵抗約氏瘧原蟲的攻擊。通過短暫封閉ES312基因免疫小鼠的CD4或CD8淋巴細胞后再進行攻擊實驗，發(fā)現(xiàn)機體抵抗紅內(nèi)期瘧原蟲感染的能力顯著增強。這些工作進一步證明，特異性CD4細胞免疫反應和體液免疫反應是抵抗紅內(nèi)期瘧原蟲感染的關鍵環(huán)節(jié)，而多表位人工抗原的特定表位基因串聯(lián)結構對能否誘導此類免疫反應是至關重要的影響因素。 此外，為了更加準確地評價一個紅內(nèi)期抗原疫苗的體內(nèi)外免疫保護效果，本研究對細胞流式分選方法檢測瘧原蟲蟲血率的方案進行了優(yōu)化，并提出了計算疫苗對瘧原蟲生長抑制率的修正公式。 本研究的結果表明，我們創(chuàng)建的表位改組方法為構建和優(yōu)化多表位人工抗原DNA疫苗提供了新的技術方向，通過大量實驗數(shù)據(jù)驗證了我們認為人工抗原空間構型決定疫苗免疫原性和免疫保護性的假設。這一新的多表位疫苗構建思路不僅有益于研制抗瘧原蟲疫苗，對其它病毒、細菌、原生動物等傳染性疾病的疫苗設計均能提供有益的思路，在抗腫瘤、抗機體過敏反應和新生兒耐受等基因治療領域也有廣泛的應用潛力。
【學位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R392
【圖文】：

VR1012質粒圖譜

pET一30a質粒圖譜

1.2單表位基因的克隆與序列分析采用兩條引物間3’端匹配序列的PCR自身退火、延伸、變性、再退火的循環(huán)特點，分別大量合成每個雙鏈表位基因(見圖2)，經(jīng)DNA純化，酶切消化，再純化濃縮后，分別與相應酶切載體VR1012連接，并轉化大腸桿菌。所得轉化子經(jīng)載體上肋日I位點檢測是否插入外源片段，和及川11確定連接方向后(見圖3)，再由序列分析確定確定最終重組質粒(如圖4)。圖2雙引物自身退火PCR擴增表位基因PAGE電泳圖 Fig.2thePAGEelectr0PhoresisofePitopegenes田 rnPlifiedbyPCRonly初 thtwoPrimersI注:因編幅問題本論文僅提供部分照片，其他可見實驗研究記錄1

【引證文獻】

相關期刊論文 前1條

1 何學虎;藺亞暉;王恒;;惡性瘧原蟲多表位疫苗M.RCAg-1在大腸桿菌中的表達和純化[J];中國生物醫(yī)學工程學報;2012年02期

本文編號：2762565