發(fā)布時(shí)間：2020-07-19 14:51

【摘要】： 瘧疾是一種在全球范圍內(nèi)嚴(yán)重影響人類健康的傳染性疾病。因瘧原蟲和蟲媒對(duì)化學(xué)藥物及殺蟲劑的耐藥性及抗藥性不斷增加，全球每年有3~5億人感染，近250萬(wàn)人死亡。導(dǎo)致目前狀況的主要病原體是惡性瘧原蟲。由于其生活周期復(fù)雜，抗原具有階段特異性、蟲株差異性和高度變異性等特點(diǎn)，長(zhǎng)期以來(lái)形成研制抗瘧原蟲疫苗的技術(shù)瓶頸。因此，針對(duì)惡性瘧原蟲不同生活時(shí)期的免疫反應(yīng)特點(diǎn)，選取誘導(dǎo)產(chǎn)生多種免疫反應(yīng)類型的不同抗原構(gòu)建多表位疫苗已經(jīng)成為研究抗瘧疫苗的熱點(diǎn)。但是，目前對(duì)多抗原表位疫苗的研究仍然是以人工合成多表位肽疫苗或單一固定的串聯(lián)多表位DNA疫苗為主，前者成本昂貴，后者免疫原性低，難以達(dá)到預(yù)期的免疫反應(yīng)多樣性和令人滿意的保護(hù)效果。為了解決多表位DNA疫苗的不足之處，我們首次借鑒了分子育種技術(shù)(即DNA改組)的隨機(jī)重組原理，將其應(yīng)用到構(gòu)建多表位DNA疫苗中，建立了一套優(yōu)化多表位人工抗原DNA疫苗的新方法——表位改組(Epitope shuffling)技術(shù)。 在本研究中，針對(duì)參與抗瘧原蟲紅內(nèi)期感染的免疫反應(yīng)類型，我們選擇了14個(gè)主要來(lái)自惡性瘧原蟲紅細(xì)胞內(nèi)期的B細(xì)胞和Th細(xì)胞表位作為研究對(duì)象。在摸索表位改組方法的過(guò)程中，先后提出并試用了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)組裝技術(shù)和同尾酶隨機(jī)重組技術(shù)，最終以同尾酶隨機(jī)重組技術(shù)構(gòu)建了五個(gè)不同基因大小的多表位基因抗原庫(kù)(依小到大命名為L(zhǎng)1、L2、L3、L4和L5)。經(jīng)聚合酶聯(lián)式反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，表明了所構(gòu)建的每個(gè)基因抗原庫(kù)均具有較高的多表位基因隨機(jī)組裝多態(tài)性。通過(guò)抗原文庫(kù)免疫方法，表明了不同多表位基因鏈長(zhǎng)度大小的抗原文庫(kù)產(chǎn)生了不同程度的免疫反應(yīng)效果。其中以2.0kb分子量的L4和1.2kb分子量的L3多表位抗原庫(kù)在免疫動(dòng)物后獲得了最好的免疫反應(yīng)水平，并在隨后用鼠瘧動(dòng)物模型進(jìn)行感染攻擊時(shí)顯示出交叉保護(hù)效果。從而證實(shí)了不同多表位人工抗原基因鏈的長(zhǎng)度對(duì)疫苗免疫原性具有重要的影響。同時(shí)，也證明了所構(gòu)建的多表位抗原庫(kù)免疫具有較理想的免疫反應(yīng)效果，適合從中篩選最佳嵌合的多表位基因。 以抗原庫(kù)免疫抗血清的有限稀釋抗體為檢測(cè)探針，通過(guò)高通量免疫化學(xué)篩選方案，分別從L3和L4的原核表達(dá)文庫(kù)中篩選到三個(gè)高免疫源性基因ES312、ES391和ES452。體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了，在相同基因表達(dá)水平的情況下，三個(gè)多表位基因的抗體反應(yīng)水平較基因大小相近的其他多表位基因高出100-200倍；而酶聯(lián)免疫吸附和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其產(chǎn)生的特異抗體具有較高多樣性。在誘發(fā)產(chǎn)生CD4細(xì)胞水平上，三個(gè)多表位基因亦均表現(xiàn)出較高的免疫誘導(dǎo)能力。在鼠瘧動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，其中多表位基因ES312免疫可獲得100％的交叉保護(hù)效果；在對(duì)惡性瘧原蟲的體外生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞流式方法檢測(cè)基因ES312的抑制率可高達(dá)95.8％�；蛐蛄蟹治鼋Y(jié)果進(jìn)一步表明了，三個(gè)高免疫原性基因在表位間組裝方式，及其編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)上均具有一定的共有保守結(jié)構(gòu)。這充分說(shuō)明了多表位基因間的組裝方式和全蛋白空間結(jié)構(gòu)決定了多表位基因疫苗的免疫原性。 通過(guò)多表位人工抗原基因的體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)其中一種人工抗原—ES312—的多表位基因串聯(lián)形式能夠在機(jī)體中誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的特異性抗體反應(yīng)，與此同時(shí)，在初次免疫后還誘導(dǎo)出以細(xì)胞因子IFN-γ為主的Th1細(xì)胞反應(yīng)，在隨后的加強(qiáng)免疫過(guò)程中又逐漸誘導(dǎo)出一定水平的Th2細(xì)胞反應(yīng)。最終證實(shí)，只有產(chǎn)生這種免疫反應(yīng)類型的小鼠才能有效地抵抗約氏瘧原蟲的攻擊。通過(guò)短暫封閉ES312基因免疫小鼠的CD4或CD8淋巴細(xì)胞后再進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)機(jī)體抵抗紅內(nèi)期瘧原蟲感染的能力顯著增強(qiáng)。這些工作進(jìn)一步證明，特異性CD4細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)是抵抗紅內(nèi)期瘧原蟲感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而多表位人工抗原的特定表位基因串聯(lián)結(jié)構(gòu)對(duì)能否誘導(dǎo)此類免疫反應(yīng)是至關(guān)重要的影響因素。 此外，為了更加準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)一個(gè)紅內(nèi)期抗原疫苗的體內(nèi)外免疫保護(hù)效果，本研究對(duì)細(xì)胞流式分選方法檢測(cè)瘧原蟲蟲血率的方案進(jìn)行了優(yōu)化，并提出了計(jì)算疫苗對(duì)瘧原蟲生長(zhǎng)抑制率的修正公式。 本研究的結(jié)果表明，我們創(chuàng)建的表位改組方法為構(gòu)建和優(yōu)化多表位人工抗原DNA疫苗提供了新的技術(shù)方向，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證了我們認(rèn)為人工抗原空間構(gòu)型決定疫苗免疫原性和免疫保護(hù)性的假設(shè)。這一新的多表位疫苗構(gòu)建思路不僅有益于研制抗瘧原蟲疫苗，對(duì)其它病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物等傳染性疾病的疫苗設(shè)計(jì)均能提供有益的思路，在抗腫瘤、抗機(jī)體過(guò)敏反應(yīng)和新生兒耐受等基因治療領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用潛力。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

VR1012質(zhì)粒圖譜

pET一30a質(zhì)粒圖譜

1.2單表位基因的克隆與序列分析采用兩條引物間3’端匹配序列的PCR自身退火、延伸、變性、再退火的循環(huán)特點(diǎn)，分別大量合成每個(gè)雙鏈表位基因(見(jiàn)圖2)，經(jīng)DNA純化，酶切消化，再純化濃縮后，分別與相應(yīng)酶切載體VR1012連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。所得轉(zhuǎn)化子經(jīng)載體上肋日I位點(diǎn)檢測(cè)是否插入外源片段，和及川11確定連接方向后(見(jiàn)圖3)，再由序列分析確定確定最終重組質(zhì)粒(如圖4)。圖2雙引物自身退火PCR擴(kuò)增表位基因PAGE電泳圖 Fig.2thePAGEelectr0PhoresisofePitopegenes田 rnPlifiedbyPCRonly初 thtwoPrimersI注:因編幅問(wèn)題本論文僅提供部分照片，其他可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)研究記錄1

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 何學(xué)虎;藺亞暉;王恒;;惡性瘧原蟲多表位疫苗M.RCAg-1在大腸桿菌中的表達(dá)和純化[J];中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào);2012年02期

本文編號(hào)：2762565