【摘要】： 目的 構建多房棘球絳蟲elp基因原核表達載體，在大腸桿菌中表達并純化重組蛋白；構建elp基因真核表達載體，在哺乳動物細胞COS7中瞬時表達以驗證其表達能力，純化重組質(zhì)粒；以原核表達重組蛋白為亞單位疫苗、真核表達質(zhì)粒為DNA疫苗免疫動物，觀察實驗動物產(chǎn)生的免疫應答；比較2種疫苗的免疫效果并觀察弗氏佐劑對亞單位疫苗和小鼠IL-12真核表達質(zhì)粒對多房棘球絳蟲DNA疫苗的佐劑作用。 方法 人工感染沙鼠，收集多房棘球絳蟲續(xù)絳期幼蟲（EMML）。用核酸純化試劑盒抽提EMML總RNA。從GenBank獲得多房棘球絳蟲elp基因cDNA序列（EM10,EMⅡ/3），設計合成PCR引物并引入內(nèi)切酶位點，用RT-PCR方法從EMML RNA制備目的基因。與此同時，比較了5種核酸提取試劑盒制備RNA的效果和不同DNA聚合酶對長片段DNA的擴增效果。應用分子克隆技術，將RT-PCR擴增產(chǎn)物插入克隆載體pGEM-11zf并進行測序和序列分析。 應用亞克隆技術將含有多房棘球絳蟲elp基因完整編碼區(qū)的DNA序列亞克隆于原核表達載體pET32a(+)和pQE30(+)。以IPTG進行誘導表達，Western blot進行鑒定。 將目的基因亞克隆于真核表達載體pcDNA3.1(+)。將elp基因真核表達重組質(zhì)粒電轉染哺乳動物細胞COS7。RT-PCR檢測COS7細胞中elp WP=14 基因轉錄產(chǎn)物，Dot-ELISA和免疫組化方法鑒定elp基因表達產(chǎn)物。 大量純化在大腸桿菌中表達的ELP重組蛋白和elp基因真核表達質(zhì)粒。將72只4-6w齡BALB/c小鼠按雌雄各半分為7組（前6組10只/組，最后1組12只）。A組：每鼠用ELP重組蛋白100μg；B組：每鼠用ELP重組蛋白100μg與等體積弗氏佐劑混合（首次為弗氏完全佐劑、第二三次為弗氏不完全佐劑）；NS組：生理鹽水對照；Ⅰ組：每鼠用真核表達空質(zhì)粒（pcDNA3.1(+)）100μg、0.75%布比卡因480μl；Ⅱ組：每鼠用elp基因真核表達重組質(zhì)粒（pcD-ELP）100μg、布比卡因480μl；Ⅲ組：每鼠用小鼠IL-12真核表達重組質(zhì)粒（pIL-12）100μg、布比卡因480μl；Ⅳ組：每鼠用pcD-ELP 100μg、pIL-12質(zhì)粒100μg、布比卡因480μl。A組和B組采用多點皮下注射；NS組、Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組均用NS調(diào)整至終體積140μl，雙側股四頭肌肌肉注射（每側70μl）。各組均免疫3次，間隔2w。 ELISA方法檢測免疫前（0w）和免疫后不同時間（首次免疫后2w、4w、6w、7w）特異性IgG1，IgG2a和IgG2b水平。雙抗體夾心ELISA試劑盒檢測首次免疫后7w各組鼠脾臟單個核細胞（PMNC)在受到特異抗原刺激后，產(chǎn)生IL-4、IL-12和IFN-γ的能力，3H-TdR摻入法檢測脾淋巴細胞的增值能力。 結果 5種商品化試劑盒或試劑中，總RNA提取試劑盒（RNeasy Total RNA Kit）效果最好。只有該試劑盒提取的EMML RNA電泳顯示出清晰的28 S、18 S rRNA條帶和彌散于0.8kb至20kb之間未降解的mRNA，是唯一能逆轉錄擴增出單一目的條帶的核酸提取物。Taq DNA聚合酶與高保真DNA聚合酶Pfu的混合制劑Taq Plus應用于RT-PCR可擴增出大量1760bp WP=15 單一目的基因�？寺y序和序列分析發(fā)現(xiàn)，EMⅡ/3和EM10是多房棘球絳蟲elp基因組基因不同的cDNA克隆，本研究構建的重組質(zhì)粒pEM10sc-11zf插入片段含有完整的elp編碼區(qū)，并且與GenBank中EM10編碼區(qū)只有一個堿基不同，即第869堿基分別為G和A，翻譯后第290位氨基酸分別為精氨酸 （CGT）和組氨酸 （CAT）。 酶切鑒定顯示本研究已將elp基因編碼序列成功地亞克隆于pET32a(+)和pQE30(+)的多克隆位點，構建了能表達目的蛋白/硫氧環(huán)蛋白（Trx）融合蛋白的原核表達重組質(zhì)粒pETrx-ELP和原核非融合表達重組質(zhì)粒pQ-ELP。SDS-PAGE及Western blot分析兩個重組質(zhì)粒在IPTG誘導下分別高效表達了83kDa Trx/ELP融合蛋白和67kDa ELP重組蛋白，分別占菌體總蛋白的23%和14～17%。經(jīng)親和層析，67kDa大小的ELP重組蛋白達到90%以上。 酶切分析證實多房棘球絳蟲elp基因編碼區(qū)已亞克隆于真核表達載體pcDNA3.1(+)，成功地構建了真核表達重組質(zhì)粒pcD-ELP。RT-PCR、dot-ELISA和免疫組化證實，重組質(zhì)粒在哺乳動物細胞COS7中能夠表達多房棘球絳蟲ELP抗原（即EMⅡ/3，EM10抗原）。 以大腸桿菌中表達的多房棘球絳蟲elp基因非融合表達產(chǎn)物即ELP重組蛋白作為亞單位疫苗，單獨或與弗氏佐劑聯(lián)合免疫BALB/c小鼠后2周（A、B組），均產(chǎn)生了大量的特異IgG1抗體，B組還產(chǎn)生了少量的特異IgG2b抗體。除B組小鼠脾PMNC產(chǎn)生了微量IFN-γ外，A組、NS組IFN-γ及各組IL-4和IL-12均未檢出。A、B組小鼠脾淋巴細胞增殖能力輕度增高，其淋巴細胞CPM值分別為NS組的2.8和10.8倍，受到多房棘球絳蟲續(xù)絳期幼蟲抗原（EMML-cAg）或刀豆素刺激時, A、B組尤其是B組淋巴細胞增殖更明顯。 WP=16 DNA疫苗免疫作用研究顯示，首次免疫后4周Ⅱ組小鼠血清中可檢測到特異性IgG1、IgG2a兩種抗體，Ⅳ組可檢測到特異性IgG1、IgG2a和IgG2b三種抗體。隨免疫時間和免疫次數(shù)的增加特異性抗體的OD值逐漸增高。首次免疫后6周Ⅱ組和Ⅳ組均可檢測到IgG1、IgG2a和IgG2b三種特異性抗體。實驗結束時（即首次免疫后7w）3種特異性抗體OD值均最高。Ⅰ～Ⅳ組小鼠脾PMNC培養(yǎng)上清中IFN-γ濃度分別為50、55、27.5和500pg/ml，受特異抗原刺激后分別為44、101.5、28.5和500pg/
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R392.1
【圖文】：

ig 1-3 Results of RT-PCR with EMML RNA Extracted with different Kit圖 1-3 不同方法提取的 EMML RNA 的 RT-PCR 結果同耐熱DNA聚合酶對EM /3和Em10擴增效果的電泳分析見圖1-4 圖示Taq增產(chǎn)物電泳上樣 3 l 可見強的單一目的條帶, 高保真酶 Pyrobest 上樣 10僅能看到微弱的目的條帶 而高保真酶 Pfu 擴增產(chǎn)物 10 l 仍看不到擴增

3.4.1 測序結果與 GenBank 中相應序列的比較重組子 pEMII/3sc-11zf 中插入的目的基因編碼區(qū)+463 位堿基為 T 而GenBank的EMII/3相應位置為 C 結果使編碼蛋白的第 155位氨基酸密碼子 CGA變成 TGA 終止密碼子 其他堿基與 EMII/3 序列相同重組子 pEM10sc-11zf 插入的目的基因與 GenBank 的 EM10 相比 編碼區(qū)+869位堿基分別為 G 和 A 在氨基酸水平上 第 290 位氨基酸 則分別為精氨酸CGT 和組氨酸 CAT 插入基因的終止密碼子后 即插入基因的第+1697位堿基為 C 而 GenBank 中 EM10 cDNA 相應位置為 T 圖 1-9CATCCCGTGGTTGGGCTCCCGTT GATTGCAGTTTACTA A A A C C A T G T T G A A G A G G A G T A A G A AT A A G A C G A A T A A G G T C A G G G T G A C T A C A G C T G A G T C A C A G TTAGAGTTTGAGATGCAGAAG G G C T C T T T G G G C C A G G A T C T C T T C G A T C A A G T G G T C C G C ACCATAGGTCTTCGTGAAGTC T G G T A C T T C G G A A T C C A G T A C A T C G A C A A A G A C G G C A A T CCAACCTTTCTAAGACTGGA

ig 2-1 Construction way of recombinant plasmid pETrx-圖 2-1 重組質(zhì)粒 pETrx-ELP 構建路線組質(zhì)粒 pEM10sc-11zf 和原核表達質(zhì)粒 pET32a(+)養(yǎng)基培養(yǎng)含 pEM10sc-11zf 的 TOP10 大腸桿菌和含 pE 以小量質(zhì)�？焖俪樘峒兓噭┖蟹謩e純化 pEM10sc原核表達質(zhì)粒 見第一章 2.3.3.3 1%瓊脂糖凝膠電泳章2.3.3.4 pEM10sc-11zf和pET32a(+)濃度約為100酶切的基礎上 設置下列酶切反應體系pEM10sc-11zf pET32a(+)

【引證文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 邵美麗;豬傳染性胸膜肺炎重組亞單位疫苗的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2006年

相關碩士學位論文 前1條

1 王勇;豬傳染性胸膜肺炎重組亞單位菌苗研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2007年

本文編號：2762255