【摘要】：干細胞(Stem cells)是一類可以進行自我更新、長期存活、在特定的生理或者實驗培養(yǎng)條件下,定向分化為功能特定的細胞。干細胞具有兩大重要特征:自我更新能力和分化潛能。自我更新是干細胞在未分化狀態(tài)下不需譜系定型的增殖。分化潛能指未分化的干細胞分化為各種類型的細胞。 間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有多向分化潛能的成體干細胞，可向多種中胚層組織細胞分化，如軟骨細胞、成骨細胞及脂肪細胞等多種成體細胞。MSCs最早發(fā)現(xiàn)于骨髓，同時也存在于其它組織中如脂肪組織和臍帶等。MSCs除了支持造血、免疫調(diào)節(jié)和多向分化的特性外,還具有靶向遷移到損傷組織、慢性炎性反應(yīng)部位及修復(fù)損傷組織的特性。當MSCs的干性受到損傷時會喪失對造血干細胞（Hematopoietic stem cells，HSCs）的支持作用，受損傷的組織不能正常修復(fù)，引起組織衰老甚至腫瘤形成。 自噬(autophagy)是真核細胞通過降解其自身的細胞質(zhì)或細胞器實行“自我消化”的一系列生化過程。自噬可以作為一種防御機制清除胞質(zhì)內(nèi)受損的細胞器、代謝產(chǎn)物，進行亞細胞水平上的重構(gòu)，保護受損的細胞。饑餓被認為是對自噬發(fā)生最有效的外源性刺激。在饑餓狀態(tài)下，細胞發(fā)生自噬，降解細胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)，進行糖酵解，從而為細胞提供能量。自噬在干細胞的干性維持中也起著重要作用。最新的文獻顯示，自噬對干細胞的自我更新和分化潛能是必要的。研究報道在造血干細胞(HSCs)中自噬的作用，發(fā)現(xiàn)當造血干細胞缺失自噬相關(guān)基因ATG-7時，造血干細胞不能存活，并且也失去了部分自我更新的能力和向造血細胞分化的潛能。也有研究者發(fā)現(xiàn)采用3-MA、ATG5-shRNA分別抑制自噬后，造血干細胞、表皮干細胞、真皮干細胞都喪失了自我更新和分化潛能。那么，當MSCs干性受到損傷時，自噬是否也參與了細胞對損傷的抵抗，從而能維持其干性。 當細胞受到電離輻射會產(chǎn)生大量的活性氧化物（Reactive oxygen species，ROS），如果細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生過量，就使得ROS在胞內(nèi)蓄積從而引起氧化應(yīng)激。為保護細胞對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，多種防御機制啟動，如抗氧化物表達的上調(diào)，泛素-蛋白酶系統(tǒng)清除交聯(lián)蛋白和自噬清除損傷的蛋白和細胞器官。當細胞受外界刺激產(chǎn)生大量ROS時，ROS及其它物質(zhì)可以通過優(yōu)先激活線粒體自噬選擇性地降解氧化損傷的線粒體，從而減輕其對細胞的損害。有研究報道T淋巴細胞缺少自噬相關(guān)基因ATG5、ATG3或ATG7時，會出現(xiàn)異常線粒體積累和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS產(chǎn)物增多，T淋巴細胞受損。大量研究已證實自噬在干細胞中調(diào)節(jié)線粒體數(shù)目和ROS水平中也發(fā)揮重要作用。ATG7缺失的造血干細胞中出現(xiàn)大量異常線粒體積累，ROS產(chǎn)生增多， DNA損傷加重，最終導(dǎo)致ATG7缺失的造血干細胞出現(xiàn)異常增殖。自噬缺乏的iPS細胞中ROS產(chǎn)生增多使自我更新能力下降。因此，自噬對間充質(zhì)干細胞的干性維持的保護作用是否是通過清除電離輻射損傷的線粒體，使ROS產(chǎn)生減少，減輕細胞DNA損傷，從而使得間充質(zhì)干細胞在受電離輻射后干性得以維持呢? 為研究自噬在間充質(zhì)干細胞輻射損傷后干性維持中的作用及機制，本課題將從以下三方面展開：第一部分研究輻射對間充質(zhì)干細胞干性維持的影響；第二部分研究自噬在間充質(zhì)干細胞輻射損傷后干性維持中的作用；第三部分研究自噬參與間充質(zhì)干細胞輻射損傷后干性維持的機制。 第一部分輻射對間充質(zhì)干細胞干性維持的影響 首先將MSCs置于電離輻射下，觀察電離輻射對MSCs干性維持的影響。研究結(jié)果表明：X-ray輻照后，MSCs表面標志物CD105、CD90和CD29與對照組相比表達下降。經(jīng)輻射的MSCs克隆集落形成數(shù)目較對照組明顯減少。Real-time PCR結(jié)果顯示，輻射的MSCs中與干性相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子Nanog, Oct4和Sox2的表達較對照組顯著降低。上述結(jié)果提示電離輻射損傷了MSCs的自我更新能力。誘導(dǎo)分化研究表明：X-ray輻照后的MSCs中成骨相關(guān)標志物ALPL, OGN和轉(zhuǎn)錄因子RUNX2-mRNA的表達下調(diào)。細胞茜素紅染色可見輻射后的MSCs形成的鈣結(jié)節(jié)數(shù)目明顯較對照組減少。X-ray輻照后的MSCs中成脂相關(guān)標志物LPL, CFD和轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ-mRNA的表達也同樣下調(diào)。且經(jīng)輻射的MSCs誘導(dǎo)分化后油紅O染色形成的脂肪滴數(shù)目較對照組減少。結(jié)果證明，電離輻射損傷了MSCs的成骨、成脂分化的潛能。上述結(jié)果提示：電離輻射不僅損傷MSCs的自我更新能力，也損傷了多向分化潛能，使MSCs干性喪失。 第二部分自噬在間充質(zhì)干細胞干性維持中的作用研究 以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs作為誘導(dǎo)自噬發(fā)生的外源性刺激，饑餓預(yù)處理后再予以X-ray照射，觀察MSCs干性維持的情況。結(jié)果表明，饑餓預(yù)處理的MSCs輻射后克隆集落形成數(shù)目增加，轉(zhuǎn)錄因子Nanog, Oct4and Sox2表達上調(diào)，自我更新能力提高。誘導(dǎo)分化實驗也觀察到了同樣的結(jié)果，饑餓預(yù)處理的MSCs輻射后，可發(fā)現(xiàn)成骨、成脂分化潛能增高。由于自噬可以作為一種防御機制保護受損的細胞，我們研究了MSCs在饑餓預(yù)處理后能夠逆轉(zhuǎn)輻射對其干性維持的損傷是否為自噬介導(dǎo)。與預(yù)期結(jié)果一致，饑餓預(yù)處理后MSCs中自噬發(fā)生。然后我們進一步利用自噬抑制劑3-MA和CQ處理MSCs，從而抑制饑餓誘導(dǎo)的自噬，再檢測自噬抑制后輻射損傷對MSCs干性維持的影響，結(jié)果顯示，抑制自噬后輻射對饑餓預(yù)處理的MSCs自我更新及成骨、成脂分化潛能的損傷加重。上述結(jié)果提示，自噬逆轉(zhuǎn)了輻射對MSCs自我更新能力和分化潛能的損傷，使其維持干性得以維持。 第三部分自噬參與間充質(zhì)干細胞輻射損傷后干性維持的機制研究 以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs作為誘導(dǎo)自噬發(fā)生的外源性刺激，饑餓預(yù)處理后再予以X-ray照射，采用細胞免疫熒光技術(shù)檢測饑餓預(yù)處理的MSCs接受輻射后ROS產(chǎn)生的數(shù)量及DNA損傷的情況，并用流式細胞儀檢測了線粒體ROS產(chǎn)生的數(shù)量及線粒體膜電位的變化。研究結(jié)果提示饑餓預(yù)處理的MSCs接受輻射后較單純輻射組ROS產(chǎn)生減少，線粒體ROS減少，線粒體膜電位上升，DNA損傷減輕。我們進一步用自噬抑制劑3-MA和CQ抑制自噬后，觀察饑餓預(yù)處理的MSCs接受輻射后ROS產(chǎn)生的數(shù)量及DNA損傷的程度，發(fā)現(xiàn)抑制自噬后，饑餓預(yù)處理的MSCs接受輻射后較對照組ROS產(chǎn)生增多，DNA損傷加重。研究結(jié)果證實，間充質(zhì)干細胞自噬的發(fā)生，清除了電離輻射損傷的線粒體，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生減少，減輕了細胞DNA損傷，從而使得間充質(zhì)干細胞在受電離輻射后干性得以維持。 綜上所述，我們的研究結(jié)果提示如下結(jié)論： 1、電離輻射不僅損傷MSCs的自我更新能力，也損傷了多向分化潛能，使MSCs干性部分喪失。 2、細胞內(nèi)自噬減輕了輻射對MSCs自我更新能力和分化潛能的損傷，使其干性得以維持。 3、間充質(zhì)干細胞自噬發(fā)生清除了電離輻射損傷的線粒體，ROS產(chǎn)生減少，減輕了細胞DNA損傷，從而使得間充質(zhì)干細胞在受電離輻射后干性得以維持。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【圖文】：

減少癥[26,27]。Atg7-/-造血干祖細胞可以明顯地累積更多異常的線氧水平，DNA 損傷和 CASPASE3 激活的凋亡（圖 2）。而且那些二次克隆。另外，在一個評價那些細胞的重建能力的試驗中，Va細胞被移植到 CD45.1+的輻照過的受體內(nèi)后，不能夠保持長期的體動物在四周內(nèi)死亡�？偠灾�，這些結(jié)果顯示自噬對于維持 H。研究者還觀察到在 Vav-Atg7 - / - 小鼠的脾臟和骨髓中髓系細胞比例是增加的，這就提示有非典型性的骨髓增生。實際上，那些細物）陽性的，而且骨髓增生在所有的 Vav-Atg7 - / -小鼠的髓系和這些結(jié)果提示在 Vav-Atg7 - / -小鼠中異常的線粒體清除被削弱，導(dǎo)而 DNA 損傷和基因改變，這些都可以說明 Vav-Atg7 - / -的 HSPCs究都支持自噬在防止基因組不穩(wěn)定，維持成體造血干細胞增值，以減少癥和癌癥中的發(fā)揮著明確作用。

2.Atg7 -/-造血干祖細胞聚積異常的線粒體，增加超氧化物，DNA 損傷和凋亡的形成。噬在干細胞分化中有細胞重塑的作用如前面所述，自噬是通過降解細胞內(nèi)受損和蛻變的某些細胞器和蛋。近期有研究表明當 T 淋巴細胞缺失自噬相關(guān)基因 Atg3, 5, 7 后，由細胞穩(wěn)態(tài)引起異常線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的積累，ROS 生成增多，細胞內(nèi)鈣步減弱鈣平衡，影響 T 淋巴細胞的存活[28-30]。自噬除了在細胞分化中起到“清道夫”的作用，并且通過細胞重塑構(gòu)的變化進一步參與到細胞的分化中。在成脂過程中，前脂肪細胞可并且使甘油三酯積聚為大的單腔脂滴[31]。Singhd 等[32]報道前脂肪細因 Atg5、Atg7 或者用自噬抑制劑 3-MA 處理后，脂肪細胞分化的標油三酯積累減少，而且這些脂肪細胞形成小的多泡脂滴而不是大的單

【共引文獻】

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本文編號：2761552