【摘要】：腫瘤壞死因子超家族(TNFSF)及其相應的受體超家族(TNFRSF)在細胞功能調控方面具有重要地位，其調控作用涉及細胞的多種行為，與機體的生理和病理過程密切相關。截止目前，至少對19種配體和29種受體進行了深入地研究。死亡受體6(DR6)，即TNFRSF21，是新近發(fā)現(xiàn)的TNFRSF成員，但其相應的配體至今沒有報道。本研究首先采用細菌雙雜交系統(tǒng)在人肝細胞cDNA文庫中篩選得到了可能與DR6相互作用的分子，對其中的hepsin與maspin進行了重組表達，在胺化磁珠上證實了重組蛋白與DR6的結合。本研究還編寫了基于蛋白質密碼理論的多肽篩選軟件，應用該軟件從hepsin與maspin分子中篩選到了可能與DR6相互作用的多肽序列，選擇合成了其中部分多肽，在細胞模型上觀察到了這些多肽誘導細胞凋亡的作用。這些結果表明：hepsin與maspin可能為DR6的配體或相互作用蛋白。 一、細菌雙雜交系統(tǒng)在細胞外蛋白質相互作用研究中的應用 利用已知的TNF相關凋亡誘導配體(TRAIL)與其3個受體(DR4、DR5、OCIF／OPG)相互作用的關系，分析細菌雙雜交系統(tǒng)研究細胞外蛋白相互作用的可行性。以帶四環(huán)素(T)抗性的pTRG構建編碼TRAIL細胞外可溶性區(qū)域表達質粒；以帶氯霉素(C)抗性的pBT構建編碼DR4，DR5，OCIF／OPG的細胞外區(qū)域序列質粒。所構建的質粒分別相應共轉化帶卡那霉素(K)抗性的報告菌株XL1-Blue MRF，鋪于含250～500μg／ml羧芐青霉素(C)，15μg／ml四環(huán)素(T)，34μg／ml氯霉素(C)，50μg／ml卡那霉素(K)的15 cm的LB平皿(LB-CTCK)，即報告基因產物以抗羧芐青霉素作為轉錄激活的指標，然后再以β-半乳糖苷酶活性進行驗證。所構建的pTRG-TRAIL與pBT-DR4，pTRG-TRAIL與pBT-DR5及對照組分別共轉化后，在500μg／ml羧芐青霉素的LB-CTCK篩選下宿主菌呈轉錄激活狀態(tài)，pTRG-TRAIL與pBT-OPG組共轉化后在250μg／ml羧芐青霉素篩選下宿主菌呈轉錄激活狀態(tài)。陽性克隆皆可在X-Gal-PETG-TCK平皿可以進一步驗證。對照組pTRG-TRAIL與pBT-LGF2，pBT-DR4與pTRG-Gal11，pBT-DR5與pTRG-Gal11或pBT-OPG與pTRG-Gal11四組共轉化后呈陰性。 由于所用的雙雜交序列皆為編碼TRAIL受體的細胞外區(qū)域，而這些蛋白質之間 王粵華博士學位論灰死亡受體6相王作用蛋白質的飾迄與鑒定 的相互作用已有驗證，由此證實了細菌雙雜交可以用于細胞外蛋白質相互作用的研 究。同時證實了OCIF/OPG與TRAIL能直接結合，但親和力較TRAIL與DR4、TRAIL 與DRS要低。 二、細菌雙雜交系統(tǒng)篩選與DR6相互作用的分子 以pBT構建編碼DR6細胞外區(qū)域(43一234aa)與Fc片段融合表達的質粒，與 Stratagene公司購買的細菌雙雜交用人肝細胞cDNA文庫(以pTRG構建)共轉化 xLI一Blue MRF，鋪于250協(xié)g/m1梭節(jié)青霉素的LB一cTCK平皿。24h后長出大量菌落 (300個/平皿)，隨機挑選10個克隆進行測序，結果顯示篩選到的主要是與Fc片段 結合的蛋白編碼序列。提高梭節(jié)青霉素濃度至500卜g/ml陽性克隆略有減少(約100 個/平皿)。 將DR6細胞外區(qū)域編碼序列直接插入pBT，按上述方法在500林g/ml羚節(jié)青霉素 的LB一CTCK平皿上篩選了8輪次，共計360余塊15 cm平皿，每次的轉化效率在 2x107一6xlo7間。結果共得到1200余個陽性克隆，用x一Gal一PETG平皿進一步驗證， 得到了約300個陽性克隆，全部進行了插入片段的序列分析。剔除已知只存在于細胞 內(如核內、胞漿、線粒體等)的蛋白編碼序列，共12次得到抗胰蛋白酶(alphal 一antitryPsin)，4次hePsin，2次未知的同一新基因，2次白蛋白，2次補體IY亞單位， 2次轉鐵蛋白(ferritin)及maspin、克隆刺激因子1受體、A一n脂蛋白、c脂蛋白、 C反應蛋白、視黃酸受體a、血清類粘蛋白1、血清素等編碼序列各1次。調研文獻 分析所報道這些蛋白的功能和研究現(xiàn)狀，選擇了H型跨膜蛋白絲氨酸蛋白酶家族分子 hePsin與絲氨酸蛋白酶抑制劑家族分子maspin進行進一步研究。 三、重組表達hcPsin與masPin，胺化磁珠法分析與DR6的結合 設計相應的引物，以肝細胞cDNA文庫為模板，PCR擴增了其中的 hePsin細胞 外區(qū)域和maspin成熟膚的編碼序列，插入pMALTM Protein Fusion and Purifieation System(New England Biolabs公司)中的pMAL一eZ載體，進行與麥芽糖結合蛋白 (MBP)融合的原核重組表達。表達產物用試劑盒所帶的直鏈淀粉親和層析柱初步純 化，達到電泳純。DR6細胞外區(qū)域同樣表達并純化。 將hepsin、maspin及MBP蛋白分別共價結合于旺源胺化(NHZ一terminated)磁珠 (云南旺源生物科技有限公司，WB 130)上，再用過量的人血白蛋白飽和磁珠。各組 各分成2管，1管加入適量純化的重組表達的DR6，另l管以MBP為對照，4℃輕搖 王架畢博士檬位論失 死亡受體6相王作用番白質的拜透與鑒定 lh。分別分析DR6、MBP加入前、后蛋白濃度的變化。結果DR6濃度在hepsin與 ma印in實驗組顯著降低，而MBp濃度基本無變化，說明DR6與hepsin或maspin能 相互結合。 四、基于蛋白質密碼理論編寫分析軟件，以驗證masPin和hcPsin中與DR6的結合 區(qū)域 蛋白質密碼理論認為，蛋白質分子相互識別的信息儲存于它們的編碼DNA序列 中，編碼受體/抗原基因的反義核營酸序列中的
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R341
【圖文】：

以本室構建的pMD一OCIFm為模板，pl、pZ為引物，peR擴增oeIF/opo編碼序列，EcoR工、BamHI雙酶切片段和相應載體pBT，T4DNA連接，酶切鑒定結果如圖1一3，可見酶切出1kb左右的OPG編碼片段。說明得到了細菌雙雜交所需的pBT-oPG融合表達載體。‘萬日五~J、釗夕皿、，三玉三二」1咤凡‘叼之2少毛甲戈「孚牙歲J壓億人七Figl一3PBT-OPGdigestedwithEeoR1andBamHI:PBT-OPGdigestedwitllEeoR1andBamHI:M:GeneRuler100bPDNAladderPlus

華博士學位論義死亡受體6相王作用蛋白質的飾迄與鑒定圖1一2酶切分析重組子Figl一2ldentifieationofreeombinantPlasmidsbyEcoR1andBamHIM:GeneRuler100bPDNAladdel·Plus:l一2:PBT-DR4andPBT-DRSdigestedwithEeoR1andBamHI3:PTRG一TRAILdigestedwitllEeoR1andBa一nHI(二)入Cl一OCIF/OpG融合表達質粒pBT-OpG的構建以本室構建的pMD一OCIFm為模板，pl、pZ為引物，peR擴增oeIF/opo編碼序列，EcoR工、BamHI雙酶切片段和相應載體pBT，T4DNA連接，酶切鑒定結果如圖1一3，可見酶切出1kb左右的OPG編碼片段。說明得到了細菌雙雜交所需的pBT-oPG融合表達載體�！f日五~J、釗夕皿、，三玉三二」1咤凡‘叼之2少毛甲?

(約100個/平皿)，但總量太多還是無法分析。用P3、P4引物，以pCMV-Flag一DR6EcD一F。為模板擴增出DR6細胞外區(qū)域編碼序列，直接插入pBT，經酶切鑒定(圖1二5)與序列分析(圖1一6)。圖1一5酶切鑒定pBT-nR6Een一FeFigl一5IdentifieationofreeombinantPlasmidsbyEeoR1andBamHIM:GeneRuler100bPDNAladderPlus::PBT-DR6ECD一FedigestedwithEeoR1andBamHI2:PBT-DR6ECDdigestedwithEeoR1andBamHI

【引證文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 陳娟;可卡因安非他明調節(jié)轉錄肽相互作用蛋白的篩選[D];第二軍醫(yī)大學;2005年

本文編號：2759381