【摘要】：腫瘤壞死因子超家族(TNFSF)及其相應(yīng)的受體超家族(TNFRSF)在細(xì)胞功能調(diào)控方面具有重要地位，其調(diào)控作用涉及細(xì)胞的多種行為，與機(jī)體的生理和病理過(guò)程密切相關(guān)。截止目前，至少對(duì)19種配體和29種受體進(jìn)行了深入地研究。死亡受體6(DR6)，即TNFRSF21，是新近發(fā)現(xiàn)的TNFRSF成員，但其相應(yīng)的配體至今沒(méi)有報(bào)道。本研究首先采用細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)在人肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選得到了可能與DR6相互作用的分子，對(duì)其中的hepsin與maspin進(jìn)行了重組表達(dá)，在胺化磁珠上證實(shí)了重組蛋白與DR6的結(jié)合。本研究還編寫(xiě)了基于蛋白質(zhì)密碼理論的多肽篩選軟件，應(yīng)用該軟件從hepsin與maspin分子中篩選到了可能與DR6相互作用的多肽序列，選擇合成了其中部分多肽，在細(xì)胞模型上觀察到了這些多肽誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。這些結(jié)果表明：hepsin與maspin可能為DR6的配體或相互作用蛋白。 一、細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)在細(xì)胞外蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用 利用已知的TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)與其3個(gè)受體(DR4、DR5、OCIF／OPG)相互作用的關(guān)系，分析細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)研究細(xì)胞外蛋白相互作用的可行性。以帶四環(huán)素(T)抗性的pTRG構(gòu)建編碼TRAIL細(xì)胞外可溶性區(qū)域表達(dá)質(zhì)粒；以帶氯霉素(C)抗性的pBT構(gòu)建編碼DR4，DR5，OCIF／OPG的細(xì)胞外區(qū)域序列質(zhì)粒。所構(gòu)建的質(zhì)粒分別相應(yīng)共轉(zhuǎn)化帶卡那霉素(K)抗性的報(bào)告菌株XL1-Blue MRF，鋪于含250～500μg／ml羧芐青霉素(C)，15μg／ml四環(huán)素(T)，34μg／ml氯霉素(C)，50μg／ml卡那霉素(K)的15 cm的LB平皿(LB-CTCK)，即報(bào)告基因產(chǎn)物以抗羧芐青霉素作為轉(zhuǎn)錄激活的指標(biāo)，然后再以β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行驗(yàn)證。所構(gòu)建的pTRG-TRAIL與pBT-DR4，pTRG-TRAIL與pBT-DR5及對(duì)照組分別共轉(zhuǎn)化后，在500μg／ml羧芐青霉素的LB-CTCK篩選下宿主菌呈轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)，pTRG-TRAIL與pBT-OPG組共轉(zhuǎn)化后在250μg／ml羧芐青霉素篩選下宿主菌呈轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)。陽(yáng)性克隆皆可在X-Gal-PETG-TCK平皿可以進(jìn)一步驗(yàn)證。對(duì)照組pTRG-TRAIL與pBT-LGF2，pBT-DR4與pTRG-Gal11，pBT-DR5與pTRG-Gal11或pBT-OPG與pTRG-Gal11四組共轉(zhuǎn)化后呈陰性。 由于所用的雙雜交序列皆為編碼TRAIL受體的細(xì)胞外區(qū)域，而這些蛋白質(zhì)之間 王粵華博士學(xué)位論灰死亡受體6相王作用蛋白質(zhì)的飾迄與鑒定 的相互作用已有驗(yàn)證，由此證實(shí)了細(xì)菌雙雜交可以用于細(xì)胞外蛋白質(zhì)相互作用的研 究。同時(shí)證實(shí)了OCIF/OPG與TRAIL能直接結(jié)合，但親和力較TRAIL與DR4、TRAIL 與DRS要低。 二、細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)篩選與DR6相互作用的分子 以pBT構(gòu)建編碼DR6細(xì)胞外區(qū)域(43一234aa)與Fc片段融合表達(dá)的質(zhì)粒，與 Stratagene公司購(gòu)買(mǎi)的細(xì)菌雙雜交用人肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)(以pTRG構(gòu)建)共轉(zhuǎn)化 xLI一Blue MRF，鋪于250協(xié)g/m1梭節(jié)青霉素的LB一cTCK平皿。24h后長(zhǎng)出大量菌落 (300個(gè)/平皿)，隨機(jī)挑選10個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示篩選到的主要是與Fc片段 結(jié)合的蛋白編碼序列。提高梭節(jié)青霉素濃度至500卜g/ml陽(yáng)性克隆略有減少(約100 個(gè)/平皿)。 將DR6細(xì)胞外區(qū)域編碼序列直接插入pBT，按上述方法在500林g/ml羚節(jié)青霉素 的LB一CTCK平皿上篩選了8輪次，共計(jì)360余塊15 cm平皿，每次的轉(zhuǎn)化效率在 2x107一6xlo7間。結(jié)果共得到1200余個(gè)陽(yáng)性克隆，用x一Gal一PETG平皿進(jìn)一步驗(yàn)證， 得到了約300個(gè)陽(yáng)性克隆，全部進(jìn)行了插入片段的序列分析。剔除已知只存在于細(xì)胞 內(nèi)(如核內(nèi)、胞漿、線粒體等)的蛋白編碼序列，共12次得到抗胰蛋白酶(alphal 一antitryPsin)，4次hePsin，2次未知的同一新基因，2次白蛋白，2次補(bǔ)體IY亞單位， 2次轉(zhuǎn)鐵蛋白(ferritin)及maspin、克隆刺激因子1受體、A一n脂蛋白、c脂蛋白、 C反應(yīng)蛋白、視黃酸受體a、血清類(lèi)粘蛋白1、血清素等編碼序列各1次。調(diào)研文獻(xiàn) 分析所報(bào)道這些蛋白的功能和研究現(xiàn)狀，選擇了H型跨膜蛋白絲氨酸蛋白酶家族分子 hePsin與絲氨酸蛋白酶抑制劑家族分子maspin進(jìn)行進(jìn)一步研究。 三、重組表達(dá)hcPsin與masPin，胺化磁珠法分析與DR6的結(jié)合 設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，以肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增了其中的 hePsin細(xì)胞 外區(qū)域和maspin成熟膚的編碼序列，插入pMALTM Protein Fusion and Purifieation System(New England Biolabs公司)中的pMAL一eZ載體，進(jìn)行與麥芽糖結(jié)合蛋白 (MBP)融合的原核重組表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物用試劑盒所帶的直鏈淀粉親和層析柱初步純 化，達(dá)到電泳純。DR6細(xì)胞外區(qū)域同樣表達(dá)并純化。 將hepsin、maspin及MBP蛋白分別共價(jià)結(jié)合于旺源胺化(NHZ一terminated)磁珠 (云南旺源生物科技有限公司，WB 130)上，再用過(guò)量的人血白蛋白飽和磁珠。各組 各分成2管，1管加入適量純化的重組表達(dá)的DR6，另l管以MBP為對(duì)照，4℃輕搖 王架畢博士檬位論失 死亡受體6相王作用番白質(zhì)的拜透與鑒定 lh。分別分析DR6、MBP加入前、后蛋白濃度的變化。結(jié)果DR6濃度在hepsin與 ma印in實(shí)驗(yàn)組顯著降低，而MBp濃度基本無(wú)變化，說(shuō)明DR6與hepsin或maspin能 相互結(jié)合。 四、基于蛋白質(zhì)密碼理論編寫(xiě)分析軟件，以驗(yàn)證masPin和hcPsin中與DR6的結(jié)合 區(qū)域 蛋白質(zhì)密碼理論認(rèn)為，蛋白質(zhì)分子相互識(shí)別的信息儲(chǔ)存于它們的編碼DNA序列 中，編碼受體/抗原基因的反義核營(yíng)酸序列中的
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R341
【圖文】：

以本室構(gòu)建的pMD一OCIFm為模板，pl、pZ為引物，peR擴(kuò)增oeIF/opo編碼序列，EcoR工、BamHI雙酶切片段和相應(yīng)載體pBT，T4DNA連接，酶切鑒定結(jié)果如圖1一3，可見(jiàn)酶切出1kb左右的OPG編碼片段。說(shuō)明得到了細(xì)菌雙雜交所需的pBT-oPG融合表達(dá)載體�！f(wàn)日五~J、釗夕皿、，三玉三二」1咤凡‘叼之2少毛甲戈「孚牙歲J壓億人七Figl一3PBT-OPGdigestedwithEeoR1andBamHI:PBT-OPGdigestedwitllEeoR1andBamHI:M:GeneRuler100bPDNAladderPlus

華博士學(xué)位論義死亡受體6相王作用蛋白質(zhì)的飾迄與鑒定圖1一2酶切分析重組子Figl一2ldentifieationofreeombinantPlasmidsbyEcoR1andBamHIM:GeneRuler100bPDNAladdel·Plus:l一2:PBT-DR4andPBT-DRSdigestedwithEeoR1andBamHI3:PTRG一TRAILdigestedwitllEeoR1andBa一nHI(二)入Cl一OCIF/OpG融合表達(dá)質(zhì)粒pBT-OpG的構(gòu)建以本室構(gòu)建的pMD一OCIFm為模板，pl、pZ為引物，peR擴(kuò)增oeIF/opo編碼序列，EcoR工、BamHI雙酶切片段和相應(yīng)載體pBT，T4DNA連接，酶切鑒定結(jié)果如圖1一3，可見(jiàn)酶切出1kb左右的OPG編碼片段。說(shuō)明得到了細(xì)菌雙雜交所需的pBT-oPG融合表達(dá)載體�！f(wàn)日五~J、釗夕皿、，三玉三二」1咤凡‘叼之2少毛甲?

(約100個(gè)/平皿)，但總量太多還是無(wú)法分析。用P3、P4引物，以pCMV-Flag一DR6EcD一F。為模板擴(kuò)增出DR6細(xì)胞外區(qū)域編碼序列，直接插入pBT，經(jīng)酶切鑒定(圖1二5)與序列分析(圖1一6)。圖1一5酶切鑒定pBT-nR6Een一FeFigl一5IdentifieationofreeombinantPlasmidsbyEeoR1andBamHIM:GeneRuler100bPDNAladderPlus::PBT-DR6ECD一FedigestedwithEeoR1andBamHI2:PBT-DR6ECDdigestedwithEeoR1andBamHI

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 陳娟;可卡因安非他明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽相互作用蛋白的篩選[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

本文編號(hào)：2759381