【摘要】：嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SevereAcute Respiratory Syndromes），又稱傳染性非典型肺炎，簡(jiǎn)稱SARS，是一種因感染SARS-CoV引起的新呼吸系統(tǒng)傳染性疾病。 本實(shí)驗(yàn)嘗試?yán)眉倚Q桿狀病毒表面展示技術(shù)將SARS-CoV主要結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白（Nucleocapsid protein）及S蛋白（Spike protein）的受體結(jié)合區(qū)域（Receptor Binding domain即RBD）共展示在桿狀病毒囊膜表面，通過(guò)低離、高離、超離等步驟純化，得到純重組桿狀病毒vBmgp64-N-RBD，滅活后免疫BALB/c小鼠獲得抗血清，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行初步研究，為SARS雙價(jià)基因工程亞單位疫苗奠定一定的基礎(chǔ)。同時(shí)構(gòu)建重組桿狀病毒vBmgp64-N、vBmgp64-RBD，后續(xù)工作同vBmgp64-N-RBD，通過(guò)比較三種免疫抗血清，研究三種重組桿狀病毒的免疫原性。首先運(yùn)用E. coLi BL21表達(dá)系統(tǒng)，分別表達(dá)SARS-CoVN蛋白和RBD蛋白，鎳柱親和層析法純化目的蛋白，得到高純度N蛋白和RBD蛋白，分別免疫新西蘭雄兔制備多克隆抗體，抗體經(jīng)純化后間接ELISA法測(cè)定其效價(jià)，N蛋白免疫獲得的抗血清達(dá)1∶25600，RBD蛋白免疫獲得的抗血清達(dá)1∶12800；然后利用Bac-to-Bac系統(tǒng)獲取重組桿狀病毒vBmgp64-N、vBmgp64-RBD、vBmgp64-N-RBD，經(jīng)SDS-PAGE、Western Blotting鑒定及激光共聚焦顯微鏡分析，結(jié)果表明三種重組桿狀病毒相應(yīng)的目的蛋白均成功表達(dá)展示于BmN細(xì)胞質(zhì)膜上，三種滅活的純重組桿狀病毒粒子免疫BALB/c小鼠，初步研究目的蛋白的免疫原性，三種重組桿狀病毒免疫小鼠獲得的相應(yīng)多抗效價(jià)均可達(dá)1∶6400，中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示vBmgp64-N、vBmgp64-RBD、vBmgp64-N-RBD免疫小鼠獲得的抗體中和效價(jià)分別為1∶16、1∶48、1∶50，說(shuō)明N、RBD蛋白具有較好的抗原性且獲得的抗體效價(jià)較高。 本實(shí)驗(yàn)首次用表面展示技術(shù)在BmN細(xì)胞中開發(fā)新疫苗，進(jìn)行了SARS疫苗研制新途徑的嘗試并取得了較好的初步結(jié)果，為后續(xù)疫苗的研究開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，且具有SARS疫苗方法學(xué)上的創(chuàng)新性。
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373
【圖文】：

SARS-CoV結(jié)構(gòu)

圖 1.2 SARS-CoV 周期Fig. 1.2 The replication cycle of SARS-CoV1.2 SARS-CoV 的結(jié)構(gòu)蛋白及其各自的功能1.2.1 棘突蛋白（Spike protein）棘突蛋白（Spike protein）：是受體結(jié)合位點(diǎn)及主要抗原位點(diǎn)。S 蛋白在 SARS-Co子表面形成花瓣?duì)钔黄�，pH 值為 6，弱酸性跨膜糖蛋白，核酸序列長(zhǎng) 3768 bp，含 12氨基酸，是目前最大的病毒結(jié)構(gòu)蛋白[9]，是 SARS-CoV 與宿主細(xì)胞受體結(jié)合、膜融合細(xì)胞過(guò)程的關(guān)鍵蛋白，也是 SARS-CoV 主要的抗原蛋白。S 蛋白前體最終形成兩個(gè)結(jié)S1 和 S2，S1 為成熟蛋白的球狀部分，參與病毒和受體的識(shí)別結(jié)合；S2 為棒狀部分，膜把整個(gè) S 蛋白固定在病毒外殼膜，以便于 S 蛋白與宿主細(xì)胞膜融合。此外，S 蛋白

浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 家蠶桿狀病毒表面展示 SARS-CoV N、RBD 蛋白及其免疫原性研RBD 基因序列是 S 蛋白的 212~550 氨基酸區(qū)段，RBD 蛋白的等電點(diǎn)為 8.3，偏堿性蛋白分子量為 38 KDa，疏水性氨基酸較多，不存在信號(hào)肽序列和跨膜區(qū)，17 個(gè)磷酸化位點(diǎn)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號(hào)：2758712