【摘要】：宿主抵抗病毒感染的第一道防線就是固有免疫反應(yīng)。固有免疫反應(yīng)以干擾素的產(chǎn)生為特征,之后干擾素誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)大量的干擾素誘導(dǎo)的抗病毒蛋白。雖然一些干擾素誘導(dǎo)的蛋白,如PKR, Mx1, RNaseL, ISG15, APOBEC3G, Tetherin, IFIT等的抗病毒功能已經(jīng)被闡明,但是干擾素誘導(dǎo)的絕大多數(shù)基因的功能尚不清楚。Viperin (Viperin, virus inhibitory protein,endoplasmic reticulum-associated, interferon-inducible)是干擾素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的具有抗病毒功能的蛋白。近來來,對(duì)于Viperin的研究受到了越來越多的關(guān)注。研究表明Viperin基因的功能是多種多樣的,從抗病毒作用到調(diào)節(jié)信號(hào)通路都發(fā)揮重要的作用。Viperin對(duì)許多種類病毒的復(fù)制都有影響,這些病毒主要包括流感病毒、丙型肝炎病毒、日本腦炎病毒、西尼羅病毒、登革熱病毒,可以抑制這些病毒的復(fù)制。有趣的是,對(duì)于人的巨細(xì)胞病毒(HCMV),干擾素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的抗病毒蛋白可以增加該病毒的感染性。相關(guān)研究表明,這種感染性的增加是通過細(xì)胞內(nèi)骨架系統(tǒng)的重建來實(shí)現(xiàn)的。Viperin對(duì)于慢病毒的作用研究并不是很多,比如人免疫缺陷病毒HIV-1,對(duì)其與Viperin的關(guān)系尚不是很明確。有些結(jié)果甚至有矛盾。比如,一組研究者證實(shí),該基因可以抑制HIV-1的復(fù)制,這種抑制是通過抑制病毒的出芽來實(shí)現(xiàn)的。另一組研究表明,Viperin只對(duì)特定毒株的HIV-1有抑制作用,而對(duì)于其他絕大多數(shù)的毒株卻沒有起作用。因此,需要更多的研究來探索Viperin在慢病毒中所起的作用。 馬傳染性貧血病毒(EIAV)是與HIV-1相似的病毒,是反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬中基因結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的病毒。感染馬傳染性病毒的馬匹通常以反復(fù)發(fā)熱為特征,同時(shí)伴有病毒血癥,發(fā)熱,血小板減小癥和衰竭癥狀。EIAV是巨噬細(xì)胞嗜性的病毒。感染的巨噬細(xì)胞是病毒的儲(chǔ)存庫(kù),在整個(gè)馬傳染性貧血的發(fā)病過程中產(chǎn)生病毒準(zhǔn)種以及作為病毒的擴(kuò)散源。由于馬傳染性貧血病毒的研究比較廣泛,深入研究EIAV與Viperin的相互作用,可為研究Viperin在慢病毒中的作用機(jī)制提供更多的資料。 為明確馬屬Viperin對(duì)馬傳染性貧血病毒的作用及其機(jī)理,本文克隆了馬的Viperin基因,并與人,恒河猴,小鼠以及豬的基因進(jìn)行了同源性比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Viperin基因的N端70個(gè)氨基酸是高變區(qū),包含了疏水的α螺旋,但是其中的幾個(gè)亮氨酸位點(diǎn)卻高度保守,表明這些保守的亮氨酸位點(diǎn)對(duì)于疏水的a螺旋區(qū)域的功能可能具有重要作用。同時(shí),SAM區(qū)域的S1基序(CxxxCxxC)含3個(gè)半胱氨酸,在已有報(bào)道的幾個(gè)物種中也是高度保守的。因此,為探明馬Viperin與EIAV相互作用的具體機(jī)制,以及與其他物種或病毒的區(qū)別,本文設(shè)計(jì)三個(gè)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：首先,我們想明確EIAV的感染是否會(huì)影響到Viperin基因的表達(dá)。本文采用定量PCR的方法,發(fā)現(xiàn)EIAV病毒感染之后,Viperin的表達(dá)在24小時(shí)以及96小時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)小高峰,在96小時(shí)的時(shí)候,接毒組是對(duì)照組的2.8倍,因此EIAV的感染可以上調(diào)Viperin的表達(dá)。其次,明確Viperin基因的表達(dá)是否會(huì)影響EIAV的感染。由于馬的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低,本實(shí)驗(yàn)通過腺病毒載體將Viperin基因?qū)腭R巨噬細(xì)胞,然后接種病毒,檢測(cè)EIAV病毒感染后48小時(shí)與72小時(shí)的病毒產(chǎn)量。結(jié)果表明,在72小時(shí)的時(shí)候,過表達(dá)Viperin的巨噬細(xì)胞的產(chǎn)毒量與對(duì)照組相比下降了將近一半(P0.05)。同時(shí),我們通過基因敲除(Knockdown)技術(shù)對(duì)巨噬細(xì)胞的Viperin基因進(jìn)行干擾。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,下調(diào)Viperin基因的表達(dá),可以促進(jìn)EIAV病毒的產(chǎn)量(P0.05)。最后,明確Viperin抑制病毒復(fù)制的機(jī)理。本文將Viperin基因與EIAV的感染性克隆共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞與上清中EIAV的病毒含量。結(jié)果表明,在細(xì)胞內(nèi)的Gag蛋白的表達(dá)并沒受到影響,但是細(xì)胞外的Gag含量隨著Viperin的增加而減少,初步表明Viperin抑制了病毒的出芽。為進(jìn)一步明確這種抑制病毒的出芽是否主要是抑制了EIAV Gag的出芽,我們用密碼子優(yōu)化過的Gag質(zhì)粒與Viperin基因共轉(zhuǎn)染,表明細(xì)胞內(nèi)的Gag蛋白表達(dá)沒有變化,但是上清中的Gag表達(dá)隨著Viperin的增多而減少。進(jìn)一步說明Viperin抑制EIAV的機(jī)制之一就是抑制Gag的出芽。為了明確Viperin抑制Gag的出芽是否是通過兩種蛋白之間的相互作用完成的,本研究利用激光共聚焦實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。通過標(biāo)簽抗體的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)兩種蛋白可以發(fā)生很好的共定位。為進(jìn)一步確定抑制Gag出芽的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,本文構(gòu)建了各個(gè)結(jié)構(gòu)域缺失的變異體。結(jié)果表明,α-helix和SAM區(qū)域?qū)τ谧璧KGag的出芽必不可少。但是三種變異體與Gag的共定位并未發(fā)生變化。我們推測(cè)兩者之間的共定位對(duì)于阻礙病毒出芽是必要的,但不是關(guān)鍵原因。其中SAM區(qū)域?qū)τ谧璧K病毒出芽更為重要,有研究表明,含有3個(gè)半胱氨酸的基序(CxxxCxxC)的變異可以增加丙型肝炎病毒,西尼羅病毒以及登革熱病毒的感染性。因此,本文將SAM區(qū)域的3個(gè)半胱氨酸進(jìn)行了突變。結(jié)果表明,突變其中1個(gè)半胱氨酸或者3個(gè)半胱氨酸同時(shí)突變,依然可以抑制EIAV感染,表明該基序并不是阻礙病毒出芽的關(guān)鍵位點(diǎn),且與Viperin抑制丙型肝炎病毒感染的機(jī)制不同。而人Viperin的SAM區(qū)域所含前三個(gè)基序S1,S2,S3對(duì)于抑制HIV-1的復(fù)制是必須的。通過構(gòu)建相應(yīng)的變異體,S1的變異并未改變Viperin阻礙Gag出芽的功能。S2的突變可以稍稍減弱其抗病毒功能,S3的變異則徹底破壞了Viperin抑制Gag出芽的功能。S1與S2的聯(lián)合突變可以破壞Viperin抗Gag出芽的能力。有趣的是,在HIV-1的研究中,S1+S2+S3的突變會(huì)影響人Viperin與HIV-1Gag的共定位,而馬的Viperin S1+S2+S3變異后,仍然可以保持與EIAV的Gag共定位。Viperin與HIV-1的研究中,只說明了Viperin限制Gag的出芽,對(duì)于其他蛋白的影響并沒有相關(guān)的研究報(bào)道。Gag和蛋白(Env)都是HIV-1與EIAV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,兩種蛋白都與病毒的成熟,出芽有關(guān)。Viperin可以抑制Gag的出芽,那么Viperin是否會(huì)影響EIAV的Env的出芽呢?EIAV gp140是表面膜蛋白gp90和跨膜蛋白gp45的前體。本文用表達(dá)gp140的真核表達(dá)質(zhì)粒與Viperin共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,結(jié)果表明,細(xì)胞內(nèi)Env的表達(dá)量隨著Viperin的增加而減少。進(jìn)一步通過構(gòu)建變異體,我們發(fā)現(xiàn)Viperin N末端的α-helix結(jié)構(gòu)域是抑制Env的表達(dá)關(guān)鍵,與其他兩個(gè)結(jié)構(gòu)域無關(guān)。因此表明Viperin抑制Env表達(dá)的機(jī)制與抑制Gag出芽的機(jī)制是不同的。 另外,EIAV的調(diào)節(jié)蛋白Tat和Rev是調(diào)節(jié)EIAV基因表達(dá)的非結(jié)構(gòu)蛋白,本文對(duì)Viperin是否抑制上述非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)也進(jìn)行了研究。通過Tat和Rev的真核表達(dá)質(zhì)粒pEIAV-Tat, pEIAV-Rev與Viperin的表達(dá)質(zhì)粒peViperin分別共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,結(jié)果表明Viperin的表達(dá)并不能影響非結(jié)構(gòu)蛋白Tat和Rev的表達(dá)。因此推斷Viperin抑制Env的表達(dá)可能是特異性的。為了證明,本文利用半定量PCR的方法,發(fā)現(xiàn)Viperin的過表達(dá)并不能影響Env的RNA水平。故進(jìn)一步推測(cè),其作用機(jī)制可能是Env蛋白合成后,通過泛素蛋白酶體途徑或者溶酶體途徑降解了。因此,本文加入了上述兩個(gè)途徑的抑制劑,MG132和氯喹。結(jié)果表明,兩種抑制劑均對(duì)Viperin抑制Env的表達(dá)無影響。證明Viperin并不是通過這兩種途徑抑制Env的表達(dá)的。當(dāng)我們用激光共聚焦觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的時(shí)候,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Viperin以及變異體(α-helix缺失變異體除外)可以在細(xì)胞內(nèi)看到明顯的囊泡狀結(jié)構(gòu)。α-helix缺失后則不能看到囊泡的產(chǎn)生。這就表明Viperin可能通過破壞細(xì)胞內(nèi)的囊膜系統(tǒng)而抑制蛋白的表達(dá)。我們接著通過電鏡觀察,進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)染含有α-helix區(qū)域的質(zhì)粒,在細(xì)胞內(nèi)均可以破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu),使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變?yōu)樾∨萁Y(jié)構(gòu),這些小泡聚集成大的泡狀結(jié)構(gòu)。有研究表明,EIAV的受體是ELRl,單獨(dú)ELR1就可以介導(dǎo)EIAV的進(jìn)入。前期研究結(jié)果表明,Viperin可以通過影響Gag的出芽以及囊膜蛋白Env的表達(dá),Viperin是否會(huì)阻礙病毒的進(jìn)入呢?本文通過慢病毒的方法構(gòu)建含有ELR1的293T細(xì)胞系,通過含有熒光素酶報(bào)告基因的EIAV偽病毒來評(píng)價(jià)Viperin對(duì)病毒進(jìn)入的影響。同時(shí)用恒河猴的(rh)TRIM5a作為陽(yáng)性對(duì)照。通過轉(zhuǎn)染HEK293T/ELR1細(xì)胞系,24小時(shí)之后接種EIAV偽病毒,接種之后24小時(shí)裂解細(xì)胞檢測(cè)熒光素酶活性,表明轉(zhuǎn)染Viperin的組可以顯著抑制EIAV的進(jìn)入(P0.05)。同時(shí),Viperin關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域中抑制病毒進(jìn)入與抑制囊膜表達(dá)的結(jié)構(gòu)域相同,都是α-helix結(jié)構(gòu)域起關(guān)鍵作用。由于EIAV的Env與ELR表達(dá)都是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)表達(dá)的,故而Viperin是否通過抑制ELR1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)抑制病毒的進(jìn)入?本文將Viperin與ELR1的真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48小時(shí)之后,Western-blot檢測(cè)結(jié)果表明,Viperin的表達(dá)可以抑制ELR1的表達(dá),與預(yù)期相符。為進(jìn)一步證實(shí)猜測(cè),本文用VSVG包裝的含有熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的EIAV偽病毒感染細(xì)胞,同時(shí)做了恒河猴rhTRIM5α的陽(yáng)性對(duì)照。由于VSVG病毒的進(jìn)入不需要細(xì)胞表面受體,發(fā)現(xiàn)Viperin阻礙偽病毒進(jìn)入細(xì)胞的能力減弱了(P0.05)；與此同時(shí),恒河猴rhTRIM5a仍可以顯著抑制病毒的進(jìn)入(P0.05),進(jìn)一步驗(yàn)證Viperin是通過抑制ELR1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)抑制病毒的進(jìn)入。 蛋白質(zhì)的合成途徑主要有兩種,細(xì)胞質(zhì)合成途徑與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成途徑,這兩種途徑合成方式主要與蛋白的定位有關(guān)。EIAV病毒的Gag,Tat,Rev蛋白的合成主要在細(xì)胞質(zhì)中,所以其細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)未受到影響。但是對(duì)于EIAV的囊膜蛋白,EIAV的受體ELR1蛋白而言,它們需要定位在細(xì)胞膜上,所以合成途徑要經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來合成。在Viperin與流感病毒,HIV-1,HCMV的相互作用中,Viperin可以抑制這些病毒的復(fù)制,但并不排除通過下調(diào)這些病毒的表面膜蛋白以及在細(xì)胞上的相應(yīng)受體來實(shí)現(xiàn)抑制病毒的。例如,HCMV的表面糖蛋白gB就能被下調(diào)。疏水的α-helix結(jié)構(gòu)域是抑制病毒囊膜蛋白以及EIAV受體蛋白表達(dá)的關(guān)鍵區(qū)域,并能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)上的變化。但這種變化是如何形成的,是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架系統(tǒng)還是別的機(jī)制仍有待進(jìn)一步的深入研究。 病毒為了能夠存活下來,已經(jīng)進(jìn)化出多種多樣的機(jī)制來對(duì)抗宿主編碼的限制因子,例如,對(duì)于抑制人免疫缺陷病病毒的天然免疫限制因子胞嘧啶脫氨酶APOBEC3G而言,HIV-1的Vif蛋白可以通過泛素蛋白酶體途徑進(jìn)行將胞嘧啶脫氨酶降解,HIV-2的Vpx也可以通過泛素蛋白酶體途徑降解SAMHD1,從而對(duì)抗SAMHD1對(duì)HIV-2復(fù)制的影響。Vpu可以通過改變Tetherin的分布來對(duì)抗Tetherin的限制。這使我們想到,EIAV是否也會(huì)進(jìn)化出相應(yīng)機(jī)制來對(duì)抗Viperin的限制呢?我們將Viperin與EIAV感染性克隆以及構(gòu)建感染性克隆的空質(zhì)粒對(duì)照進(jìn)行共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。通過Western-blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白含量。結(jié)果表明,在蛋白表達(dá)的水平上,EIAV并不能對(duì)Viperin的表達(dá)有影響,也不能降解Viperin,更不能像其它病毒能夠產(chǎn)生一些效應(yīng)蛋白降解抗病毒分子。咎其原因,可能是EIAV誘導(dǎo)的Viperin表達(dá)上調(diào)了2.8倍。但這也可能不足以完全的抑制病毒的復(fù)制,例如內(nèi)源性的Viperin也可能不足以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的病變。另一種可能就是,EIAV可能通過其他方式來對(duì)抗Viperin,而不是將其降解的途徑來實(shí)現(xiàn)的。 綜上所述,馬的Viperin是抑制馬傳染性貧血病毒的天然免疫限制因子。本文的研究有助于加深對(duì)Viperin抗病毒作用機(jī)理的認(rèn)識(shí),更擴(kuò)大了Viperin的抗病毒譜范圍。本文研究結(jié)果表明,Viperin抑制EIAV的復(fù)制是全方位的。首先,Viperin具有抑制EIAVGag出芽的功能,主要與α-helix和SAM結(jié)構(gòu)域相關(guān)。而且,SAM結(jié)構(gòu)域抑制Gag出芽的關(guān)鍵位點(diǎn)與人Viperin抑制HIV-1Gag出芽的機(jī)制不同。其次,Viperin的過表達(dá)可以抑制EIAV病毒囊膜基因以及EIAV受體的表達(dá)。主要作用機(jī)制是通過Viperin N末端疏水的α-helix結(jié)構(gòu)域,破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常結(jié)構(gòu)來抑制囊膜蛋白的表達(dá)降低病毒的產(chǎn)量,抑制EIAV受體的表達(dá)進(jìn)而抑制病毒的進(jìn)入。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

圖1.馬傳染性貧血病毒基因結(jié)構(gòu)Figl. Genome structure of EIAV1.1.3 EIAV結(jié)構(gòu)基因功能Gag和pol的基因產(chǎn)物由全長(zhǎng)的病毒mRNA翻譯而成[7]。Gag-Pol多聚蛋白合成需要核糖體跳躍式翻譯閱讀跳過gag終止密碼子。一些關(guān)鍵基序如AAAAAAC滑動(dòng)基序，滑動(dòng)基序下游的的一個(gè)5堿基GC配對(duì)片段和一個(gè)假結(jié)構(gòu)影響Gag-Pol跳躍式翻譯t8]。Gag前體蛋白在細(xì)胞質(zhì)膜的組裝對(duì)于病毒從宿主細(xì)胞的出芽是必需的。EIAV蛋白酶將Gap前體（Pr55gag)多聚蛋白剪切成為成熟病毒粒子內(nèi)部的4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：膜相互作用的基質(zhì)蛋白（MA)pl5,衣殼蛋白（CA) p26,與RNA結(jié)合的核蛋白（NC) pll和（圖1)。Gag蛋白水解過后，MA仍然與病毒內(nèi)膜相結(jié)合，同時(shí)CA蛋白濃縮形成包裹NC/RNA復(fù)4

博士學(xué)位論文 廣應(yīng)用并獲得成功，成功控制了 EIAV的流行，其作為唯一被成功大規(guī)模應(yīng)用并誘導(dǎo)了良好慢病毒免疫保護(hù)的疫苗，具有重大的理論和實(shí)際意義。探討EIAV疫苗株致弱和誘導(dǎo)免疫保護(hù)的機(jī)制，將對(duì)慢病毒免疫研究和制定疫苗研制策略提供有益的參考。

圖5. EIAV感染后Viperin表達(dá)情況quine Viperin mRNA expression increased post EIAV infection. Equine med with 2.5ng RT EIAV, after that, Viperin and P-actin mRNA expry real-time PCR. The numbers of Viperin mRNA copies were normalizeda represent the Mean 土 SD for three independent experiments.達(dá)Viperin抑制EIAV復(fù)制馬巨嗟細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低，本實(shí)驗(yàn)采用構(gòu)建好的含有Viperin在馬巨唾細(xì)胞巾過表達(dá)Viperin，通過檢測(cè)上清中EIAV的反轉(zhuǎn)果表明，EIAV感染48小時(shí)后各處理組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（。含有Viperin的重組腺病毒組在EIAV感染48小時(shí)，雖有降，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)。EIAV感染72小時(shí)后，各處理意義(F=6.122，P=0.036)。并且EIAV感染72小時(shí)后可以明顯的產(chǎn)量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)(圖6，表4-1)。

【共引文獻(xiàn)】

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2 張娟;侵染甘薯的雙生病毒的研究[D];大連理工大學(xué);2006年

3 王登峰;EIAV FDDV疫苗株免疫馬后部分體液免疫指標(biāo)的監(jiān)測(cè)與表達(dá)EIAV受體和熒光素酶報(bào)告基因的293細(xì)胞系的建立[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

4 王雪峰;中國(guó)馬傳染性貧血病毒驢強(qiáng)毒株與驢白細(xì)胞弱毒疫苗株前病毒全基因組序列分析[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

5 楊旭艷;馬慢病毒受體1插入型選擇性剪接體的原核表達(dá)[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

6 高華;馬傳貧病毒中國(guó)株S2基因原核表達(dá)及多克隆抗體制備[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

7 陽(yáng)凱;EIAV減毒疫苗誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)時(shí)相及膜抗原改造研究[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2009年

8 鐘志成;帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記的中國(guó)馬傳染性貧血病毒疫苗株感染性克隆的構(gòu)建[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

9 徐峰;基于病毒宿主蛋白—蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行病毒分類[D];東北林業(yè)大學(xué);2010年

10 王穎君;樹

本文編號(hào)：2758705