發(fā)布時(shí)間：2020-07-16 23:48

【摘要】：為了明確PTHrP NLS和C末端缺失引起的腦發(fā)育障礙是否與神經(jīng)干細(xì)胞自我更新能力降低有關(guān),我們通過原代和傳代培養(yǎng)3天齡PTHrP KI (PTHrPNLS和C末端缺失)和WT小鼠海馬區(qū)來源的神經(jīng)干細(xì)胞,利用神經(jīng)球計(jì)數(shù)、BrdU摻入、流式細(xì)胞儀分析和Western blot的方法比較分析了PTHrP KI和WT小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的表型變化。結(jié)果顯示：原代和傳代神經(jīng)球形成效率及傳代／原代神經(jīng)球比例在PTHrP KI小鼠較WT小鼠明顯降低；神經(jīng)干細(xì)胞增殖在PTHrP KI小鼠較WT小鼠明顯降低,而神經(jīng)干細(xì)胞凋亡在PTHrP KI小鼠較WT小鼠明顯增加；CDK2和CDK4表達(dá)水平在PTHrP KI神經(jīng)干細(xì)胞中顯著下調(diào)；而p16、p21和p27以及Caspase-3在PTHrP KI神經(jīng)干細(xì)胞中顯著上調(diào)。這些結(jié)果說明：PTHrP NLS和C末端能夠通過激活細(xì)胞周期依賴性激酶CDK2和CDK4,抑制p16、p21、p27,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖,抑制凋亡,而發(fā)揮維持神經(jīng)干細(xì)胞自我更新能力的作用。 為了明確甲狀旁腺素相關(guān)肽PTHrP NLS和C末端缺失對(duì)脊髓發(fā)育的影響,我們利用組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)等方法,比較分析了1周或2周齡PTHrP KI和同窩WT小鼠脊髓的表型差異。結(jié)果顯示：PTHrP KI小鼠脊髓長(zhǎng)度變短,重量減輕,頸段和腰段脊髓橫切面截面積變小。NeuN陽性細(xì)胞百分率在PTHrP KI小鼠脊髓中明顯減少；MBP陽性少突膠質(zhì)細(xì)胞面積和髓鞘形成數(shù)目在PTHrP KI小鼠脊髓中明顯減少。PCNA陽性神經(jīng)細(xì)胞百分率在PTHrP KI小鼠明顯減少；Cyclin D1、CDK4和CDK6mRNA表達(dá)水平和Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4、CDK6蛋白表達(dá)水平在PTHrP KI小鼠脊髓中明顯下調(diào),而p16、p19、p21和p27基因和蛋白表達(dá)水平在PTHrP KI小鼠脊髓中均明顯上調(diào)；這些結(jié)果說明：PTHrP NLS和C末端能夠通過促進(jìn)脊髓神經(jīng)干細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化,加速髓鞘形成,而發(fā)揮促進(jìn)脊髓發(fā)育的作用。 為了研究p27是否作為PTHrP NLS的下游靶標(biāo)之一參與了PTHrP NLS對(duì)腦發(fā)育的調(diào)節(jié),我們建立了p27-/-KI小鼠模型,運(yùn)用組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)和Western Blot等方法,比較分析了2周齡p27-/-KI小鼠與同窩p27-/-、PTHrPKI及WT小鼠腦的表型差異。結(jié)果顯示：p27基因敲除能夠延長(zhǎng)PTHrP KI小鼠生存期,并改善其生長(zhǎng)發(fā)育；增加PTHrP KI小鼠腦重,改善其腦形態(tài)發(fā)生異常；上調(diào)CyclinD1,下調(diào)p19和p53,促進(jìn)PTHrP KI小鼠腦各部神經(jīng)細(xì)胞增殖；促進(jìn)PTHrP KI小鼠腦各部的神經(jīng)元分化,改善小腦外顆粒層神經(jīng)細(xì)胞的遷移和成熟；增加PTHrP KI小鼠腦各部GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞和MBP陽性少突膠質(zhì)細(xì)胞面積。Shh通路相關(guān)分子Shh、Smo、Gli1/2和Bmi-1表達(dá)水平在p27-/-小鼠腦組織中明顯上調(diào)；在PTHrP KI小鼠中明顯下調(diào),而敲除p27能夠上調(diào)這些分子在PTHrP KI小鼠腦組織中的表達(dá)。這些結(jié)果說明：p27能夠通過激活Shh通路,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化,而發(fā)揮改善PTHrP NLS和C末端缺失引起的腦發(fā)育障礙。 本研究結(jié)果不僅進(jìn)一步闡述了PTHrP NLS和C末端在調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用機(jī)制,也為將PTHrP NLS和C末端應(yīng)用于促進(jìn)神經(jīng)再生的臨床研究提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R338
【圖文】：

圖1 PTHrP N-末端、中間段、核定位序列和C末端功能及信號(hào)通路圖為了研宄PTHrP確切的生理功能，Karaplis]3等利用胚胎干細(xì)胞同源基因重組技術(shù)，建立了 PTHrP基因敲除小鼠。PTHrP純合子小鼠出生后不久即死于窒息，呈現(xiàn)明顯的軟骨發(fā)育不良。該研究指出，PTHrP在胚胎發(fā)育期最明顯的作用是刺激軟骨細(xì)胞的增殖、抑制軟骨細(xì)胞的分化和凋亡。在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中，由NLS引導(dǎo)的蛋白入核是核內(nèi)外物質(zhì)進(jìn)行信息交流的重要環(huán)節(jié)，在細(xì)胞的增殖、分化、闊亡和轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。對(duì)于PTHrP核定位序列（NLS)的研究始于1995年，Henderson丨4等的研究證實(shí)PTHrP含有NLS，該序列可以將異源性胞團(tuán)蛋白輸送到細(xì)胞核并有抗細(xì)胞凋亡作用。在血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs)，PTHrP的NLS可通過細(xì)胞內(nèi)分泌方式促進(jìn)VSMC增殖，而N-末端和中間區(qū)無刺激VSMC增殖作用。但僅有NLS卻

基因型鑒定

圖3 PTHrP KI對(duì)小鼠的腦外形和形態(tài)學(xué)變化的影響(A)3天齡WT和KJ小鼠腦大體照和（B)腦重，（C) HE染色腦矢狀面顯微圖像（12.5X)。*: p<0.05,與 WT 小鼠相比。2. PTHrP NLS和C末端缺失對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞自我更新能力的影響為了明確PTHrP NLS和C末端缺失導(dǎo)致的小鼠腦發(fā)育異常是否與神經(jīng)干細(xì)胞自我更新能力降低有關(guān)，我們從3天齡PTHrP KI和WT小鼠腦海馬區(qū)分離神經(jīng)細(xì)胞，進(jìn)行原代及傳代培養(yǎng)，觀察神經(jīng)球形成效率，并利用圖像分析對(duì)yL經(jīng)球進(jìn)行計(jì)量分析。我們分析了原代yL經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)3天、6天、9天時(shí)神經(jīng)球的形成情況，并對(duì)培養(yǎng)9天形成的神經(jīng)球根據(jù)大小進(jìn)行了計(jì)量分析。結(jié)果顯示：神經(jīng)球形成數(shù)目在3、6和9天野生型和PTHrP KI小鼠神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)中均逐漸增加，

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 郭樂深;劉錦德;;高可用CORBA[J];計(jì)算機(jī)科學(xué);2000年02期

2 王明文;孫永強(qiáng);;可移動(dòng)代碼的一種優(yōu)化技術(shù)[J];計(jì)算機(jī)科學(xué);2000年01期

3 Li He;Q.Richard Lu;;Coordinated control of oligodendrocyte development by extrinsic and intrinsic signaling cues[J];Neuroscience Bulletin;2013年02期

本文編號(hào)：2758677