【摘要】：繼2000年6月人類基因組框架圖繪制完成后，2001年2月研究者又宣布人類 基因組共有32億個堿基對，約3.4萬個蛋白編碼基因，其數(shù)字遠遠低于最初預(yù)計的 14萬個基因。這給我國的基因組研究帶來了更大的壓力，只有加快研究速度，努力 發(fā)現(xiàn)新基因，深入研究和探討新分子的生物學(xué)功能以及對疾病診斷、治療的意義， 我們才能擠身世界生物科學(xué)研究的前沿，形成具有我國自己知識產(chǎn)權(quán)的學(xué)術(shù)特色。 樹突狀細胞(Dendritic cells，DC)是人體內(nèi)重要的抗原提呈細胞，本研究所對 DC的分化發(fā)育及其介導(dǎo)的腫瘤免疫治療的研究工作己進行多年，并在此基礎(chǔ)上建立 了人樹突狀細胞基因文庫，通過大規(guī)模隨機測序的方法開展了從DC中克隆新分子 的工作，從2萬余條EST中發(fā)現(xiàn)了許多新的分子。在本課題中，我們選擇其中4個 進行了克隆表達和生物學(xué)功能研究。 鳥昔酸還原酶(guanosine monophosphate reductase，GMPR)(EC 1.6.6.8)主要催化 鳥嗓吟核苷酸(GMP)向次黃嘌呤核苷酸(IMP)的轉(zhuǎn)化：GMP＋NADPH＋2H＋→IMP＋ NH4＋NADP＋。該酶所催化的反應(yīng)對維持細胞內(nèi)腺嘌呤和鳥嘌呤核苷酸的平衡發(fā)揮 著重要作用。細胞內(nèi)鳥嘌呤核苷酸池的含量與前髓性白血病HL-60細胞的分化密切 相關(guān)。我們從人樹突狀細胞cDNA文庫中分離到一個新的全長cDNA，編碼一個由 348個氨基酸組成的未知蛋白。該蛋白質(zhì)與人鳥苷酸還原酶在氨基酸水平上有高達 79%的同源性，并暫時命名為GMPR2。Northern雜交分析顯示新分子的mRNA廣 泛表達于正常人體組織及多數(shù)腫瘤細胞系。將構(gòu)建的真核表達載體pcDNA3.1－ GMPR2用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染COS7細胞，經(jīng)瞬時表達獲得myc-His融合的重組新分子蛋 白。通過生物化學(xué)方法，我們證實新分子蛋白具有催化鳥苷酸還原的酶學(xué)活性。用 同樣的方法將pcDNA3.1-GMPR2轉(zhuǎn)染HL-60細胞，證實其經(jīng)佛波脂(TPA)誘導(dǎo)向單 核細胞的分化作用明顯增強。因此，通過本課題的研究我們發(fā)現(xiàn)了一個新的人鳥苷 酸還原酶分子，并且該分子與HL-60白血病細胞的分化密切相關(guān)。 6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶(glucosamine-6-phosphate isomerase，GMII)又名 6-磷酸 葡萄糖胺脫氨酶(glucosamine-6-phosphate deaminase，GMPDA)(EC 5.3.1.10)，主要催 化6-磷酸葡萄糖胺分解生成果糖和氨。該反應(yīng)是N-乙酚-6-磷酸葡萄糖胺分解代謝 二 博」：學(xué)位論文 Molecular cloning and characterlzatlon ofnovel proteins derived from human dendrltlc cells． 途徑的最后一步，包括6－磷酸葡萄糖胺的醛酮異構(gòu)和加氨或脫氨過程。人GNPI的 生物學(xué)功能尚不明確。有研究者從倉鼠的精細胞中克隆純化到一種可溶性蛋白 ＊scillin），該蛋白經(jīng)微注射入小鼠卵細胞內(nèi)可誘發(fā)鈣離子濃度的震蕩，這一變化與 卵細胞受精時所發(fā)生的變化相同。而Oscillin在氨基酸水平上與細菌的GNPI有高達 53％的同源性。從人樹突狀細胞基因文庫中我們分離到一個新的全長CDNA克隆， 編碼一個由276個氨基酸組成的未知蛋白。該蛋白質(zhì)與人個磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶和 Oscillin在氨基酸水平上均有高達87％的同源性，暫時命名為GamIZ。Northern 雜 交分析顯示新分子的znRNA廣泛表達于正常人體組織及多數(shù)腫瘤細胞系。其組織表 達譜與GNPI不同。通過與前一分子相同的技術(shù)路線，我們表達了GWIZ的重組蛋 白，并通過生化法證實該新分子重組蛋白具有催化6－磷酸葡萄糖胺分解生成果糖的 酶學(xué)活性。因此，我們認為該新分子是一個新的人卜磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶，可能是 與GNPI分布在不同組織和腫瘤細胞，并發(fā)揮相同催化作用的同功酶。 脂肪酸在線粒體內(nèi)的p氧化是細胞能量的主要來源。脂肪酚輔酶A脫氫酶歸cyl－ coe…e A dehydrogenase，ACDs）主要催化脂肪酸在線粒體內(nèi)p氧化的第一步，是脂 肪酸氧化的限速酶。特長鏈酚輔酶 A脫氫酶WLCAD＊EC．3．99．13）主要催化含 14 20個碳原子的特長鏈酚輔酶A的氧化。由于長鏈脂肪酸是人類心臟、肝臟、骨骼肌 等組織的主要能源，因此，VLCAD的缺陷常導(dǎo)致嚴(yán)重的新生兒原發(fā)性心肌病 kardiomyopathyX 不明原因的新生兒碎死、低酮性低血糖、肝功能衰竭等。我們從 人樹突狀細胞基因文庫中分離出一個新的ACDS家族的同源基因，暫時命名為 ACAD習(xí)。該基因包含一個 1866 hp的完整閱讀框，共編碼 621個氨基酸。ACAD習(xí) 與VLCAD有65％的同源性。ACAD－9的W優(yōu)勢表達于人的心臟，骨骼肌、 腦、腎臟及肝臟等組織。通過生化方法證實ACAD－9可以催化軟脂酚輔酶A和硬脂 酚輔酶A的p氧化。我們推測，ACAD習(xí)是ACDS家族的一個新成員，該基因的突變 可能與新生兒碎死及原發(fā)性心肌病的發(fā)病密切相關(guān)。 細胞死亡有兩種不同的機制，壞死和凋亡。它們在細胞形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)上有 著明確的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)。TNF－0既可以誘導(dǎo)小鼠成纖維肉瘤L929細胞發(fā)生壞死，也可以 誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。據(jù)推測，兩種不同細胞死亡方式可能分別山不同的TNF抵抗蛋白 進廳調(diào)節(jié)。我們分離出一個新的CDNA克隆，它?
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號】：R392.12

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本文編號：2757557