發(fā)布時(shí)間：2020-07-16 02:55

【摘要】：諾如病毒（Norovirus, NoV）是全球非細(xì)菌性腹瀉的主要病因。1968年NoV被首次報(bào)道，至上世紀(jì)90年代中期GⅡ.4型NoV成為了全球主要流行株，并且此后每隔兩三年就產(chǎn)生變異株并引起新一輪傳播，因此也被成為“腸胃炎流感”。近年來(lái)我國(guó)NoV疫情頻繁暴發(fā)，對(duì)抗病毒研究提出了更緊迫的要求，然而NoV體外復(fù)制體系的缺乏增加了病毒研究的困難。檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，尤其是PCR技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)NoV傳播特點(diǎn)與分布規(guī)律研究具有重要意義。同時(shí)，PCR技術(shù)還促進(jìn)了NoV序列的積累，這不但有助于了解病毒基因組特征，而且加深對(duì)其進(jìn)化機(jī)制的認(rèn)識(shí)。近年來(lái)有學(xué)者提出，宿主對(duì)病毒感染的的免疫保護(hù)作用以及人類血型組織抗原作為病毒受體是NoV進(jìn)化的兩大約束性因素。 NoV序列的積累已經(jīng)成為了病毒進(jìn)化及抗病毒研究的基礎(chǔ)，因此本論文以病毒序列為中心，分別針對(duì)檢測(cè)技術(shù)開(kāi)發(fā)、病毒污染調(diào)查、基因組序列克隆、病毒序列進(jìn)化分析等內(nèi)容展開(kāi)研究，具體工作如下： 1、NoV檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化研究。在構(gòu)建通用性DNA/RNA質(zhì)控品的基礎(chǔ)上，優(yōu)化并評(píng)價(jià)了不同引物、不同類型的RT-PCR檢測(cè)NoV技術(shù)，建立了各種方法檢測(cè)靈敏度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，為實(shí)際工作中選擇合適的檢測(cè)方法提供了參考依據(jù)。此外，還比較了不同方法抽提病毒核酸的差異，其中膜純化方法效果最佳，同時(shí)考察了膜層析、超濾濃縮及免疫板捕獲病毒等前處理方法回收病毒的效果。 2、廣州地區(qū)冬季散發(fā)性腹瀉中病毒感染調(diào)查。調(diào)查了廣州地區(qū)冬季散發(fā)性腹瀉樣本中的病毒感染狀況，從89份樣本中檢出9份NoV陽(yáng)性和32份輪狀病毒陽(yáng)性。對(duì)病毒部分聚合酶區(qū)及衣殼蛋白區(qū)的序列分析顯示，所有NoV均為GⅡ基因型，其中GⅡ.4型占5/9，GⅡ.6型占3/9，另外還包括一株GⅡ.b/GⅡ.3重組株。 3、GⅡ型NoV基因組序列克隆與特征分析。建立了一種簡(jiǎn)單通用的GⅡ型NoV基因組克隆方法，并克隆得到3條我國(guó)華南地區(qū)不同型別NoV流行株的基因組序列。同時(shí)，收集已公布的GⅡ型NoV基因組，分析其不同蛋白編碼區(qū)的同源性及進(jìn)化特征差異，結(jié)果顯示p22蛋白、P2區(qū)和VP2蛋白為易變異區(qū)域，進(jìn)一步對(duì)以上區(qū)域進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，提示VP1與VP2蛋白可能存在共進(jìn)化現(xiàn)象。 4、GⅡ.4型NoV衣殼蛋白進(jìn)化分析。收集已公布的GⅡ.4型NoV衣殼蛋白序列，通過(guò)多重序列比對(duì)篩選病毒進(jìn)化中出現(xiàn)的信息位點(diǎn)，分析其中的關(guān)鍵位點(diǎn)及其在病毒衣殼上的分布，然后借助同源建模比較不同GⅡ.4型NoV流行株P(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)差異，計(jì)算關(guān)鍵位點(diǎn)的表面積變化情況，從而分析了各位點(diǎn)的氨基酸使用范圍，并預(yù)測(cè)衣殼蛋白上可能的抗原表位。 病毒檢測(cè)技術(shù)開(kāi)發(fā)和序列信息積累是NoV研究的重要工具，因此，本論文圍繞NoV序列展開(kāi)研究，建立了標(biāo)準(zhǔn)的RT-PCR檢測(cè)NoV技術(shù)，并應(yīng)用于臨床樣本調(diào)查，同時(shí)克隆、分析了GⅡ型NoV的基因組序列特征，最后對(duì)主要流行GⅡ.4型NoV衣殼蛋白序列的進(jìn)化機(jī)制進(jìn)行探索。NoV高流行性和易變異的特征對(duì)認(rèn)識(shí)病毒提出了迫切的需求，本論文關(guān)于病毒檢測(cè)及進(jìn)化機(jī)制的研究不僅有助于預(yù)測(cè)NoV的進(jìn)化趨勢(shì)，也將為開(kāi)發(fā)有效的病毒疫苗和治療手段提供重要的理論指導(dǎo)。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373.25;R3416
【圖文】：

諾如病毒（Norovirus, NoV）是全球流行性與散發(fā)性急性胃腸炎的主要病因之一，每年至少導(dǎo)致 100 萬(wàn)次病患就診和 20 萬(wàn)例 5 歲以下兒童死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。1968 年美國(guó)俄亥俄州諾瓦克鎮(zhèn)暴發(fā)腸胃炎疫情，當(dāng)?shù)匾凰W(xué) 50%學(xué)生和 32%家庭成員出現(xiàn)腹瀉或嘔吐癥狀[5]。1972 年 Kapikian 等利用免疫電鏡技術(shù)觀察到了該次疫情的病原，將之命名為諾瓦克病毒（Norwalk Virus）[6]。其后一系列形態(tài)相似、同源性高、具有一定抗原性差異的病毒又陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，國(guó)際病毒分類委員會(huì)將其統(tǒng)一歸為一屬，并在2002 年第八次國(guó)際病毒命名會(huì)議上正式定義為諾如病毒。1.1 病原學(xué)NoV 曾被稱為類諾瓦克病毒或小圓結(jié)構(gòu)病毒，是一組形態(tài)相似、抗原性略有不同的病毒粒子，屬于杯狀病毒科（Calicivirus）諾如病毒屬。NoV 顆粒直徑約 27-38nm，無(wú)包膜，表面粗糙，分布有 32 個(gè)杯狀凹陷，呈 T=3 的二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)；電鏡觀察顯現(xiàn)為具有典型的羽狀外緣且表面有凹痕的小圓狀結(jié)構(gòu)病毒。

第一章 緒論毒，GII 型中還包括豬源 NoV，GIII 型可感染羊和奶牛，GIV 型感染人、狗和獅子，GV型為鼠源病毒，最近新出現(xiàn)的 GVI 型病毒可以感染人和狗[27]。目前還沒(méi)有從人類中分離到動(dòng)物源病毒，但從動(dòng)物中已經(jīng)檢出人源 NoV，例如從羊糞便中分離得到的 GII 型病毒和人源 NoV 同源性很高[28]，并且人源 GII.4 型 NoV 可以感染無(wú)菌豬和牛。人源和動(dòng)物源 NoV 的 P2 區(qū)域結(jié)構(gòu)差異很大，跨種系傳播的可能性比較小[29, 30]，但 SARS 與禽流感病毒的暴發(fā)提醒廣大科研工作者仍要加大病毒的監(jiān)控力度。每個(gè) NoV 基因組還可進(jìn)一步分為不同的基因型，目前 GI 型包括 9 個(gè)基因型，GII型至少含有 19 個(gè)，GIII 型與 GIV 型各含有 2 個(gè)，GV 型只有 1 個(gè)。根據(jù)序列相似性，同一基因型又可進(jìn)一步分成不同的基因簇，同一基因簇內(nèi)病毒的衣殼蛋白相似性很大，例如 GII.4 型 NoV 不同簇間核苷酸變異率僅 2%左右[31]。1.2.3 結(jié)構(gòu)蛋白

A:B 形成衣殼表面，通過(guò)將 A:B 二聚體插入到 C:C 內(nèi)殼中形成一個(gè)含有突起的緊密衣殼結(jié)構(gòu)。S 和 P 區(qū)在結(jié)構(gòu)和功能上是獨(dú)立的，單獨(dú)表達(dá) S 區(qū)可以形成一個(gè)略小的光滑顆粒（約 27nm），與病毒衣殼的內(nèi)表面相對(duì)應(yīng)，但不能結(jié)合病毒受體。Tan 等嘗試使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備 VP1 蛋白[47]，盡管不能形成顆粒，但具有與野生病毒相似的受體結(jié)合功能和免疫原性。單獨(dú)表達(dá) P 區(qū)域可以形成不同類型的顆粒，包括 P 顆粒（24 聚體，直徑約 20nm）[20, 48-50]、小 P 顆粒（12 聚體，直徑約 14nm）[51]以及 P 二聚體[47]。原生質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在還原條件下 24 聚體狀態(tài)的 P 顆�？梢灾匦滦纬� 12 聚體的小 P 顆粒和其他兩種顆粒（18 聚體和 36 聚體）[52]，說(shuō)明顆粒結(jié)構(gòu)是可以轉(zhuǎn)換的，并均以 P 二聚體作為基礎(chǔ)。和 S 顆粒不同的是，以上三種 P 顆粒均可以和受體結(jié)合，從而表明 P 區(qū)域是病毒的受體結(jié)合區(qū)域。因此，目前 P 區(qū)域被廣泛的用于了 NoV的功能研究，而其中 24 聚體的 P 顆粒是被研究和應(yīng)用最為廣泛的，穩(wěn)定性高、表達(dá)量大、易于整合外源抗原、形狀較大并具有多價(jià)抗原等優(yōu)點(diǎn)使其成為病毒疫苗制備的重要候選對(duì)象。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 方肇寅，溫樂(lè)英，晉圣瑾，趙章華;在我國(guó)腹瀉患兒中發(fā)現(xiàn)諾瓦克樣病霉感染[J];病毒學(xué)報(bào);1995年03期

2 譚冬梅;劉巍;鄧麗麗;唐振柱;楊哲;黃兆勇;謝鎮(zhèn)國(guó);方志鋒;楊進(jìn)業(yè);董柏青;;南寧市散發(fā)性腹瀉諾如病毒分子流行病學(xué)分析[J];中國(guó)公共衛(wèi)生;2011年11期

3 吳清平;薛亮;張菊梅;;諾如病毒流行株GⅡ.4型進(jìn)化研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)報(bào);2012年12期

本文編號(hào)：2757416