【摘要】：研究目的 干擾素(Interferons, IFNs)是機體內(nèi)一種重要免疫炎癥介質,具有抗病毒、抗細菌、抗腫瘤和免疫調節(jié)的作用。IFNs通過JAK-STAT信號通路激活信號轉導轉錄活化因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)進而啟動目標基因的轉錄。大量的研究證明,異常的IFNs信號會導致各種免疫性疾病的發(fā)生,目前調控IFNs信號的分子機制仍然不清楚。 Smad泛素化調節(jié)因子1(Smad ubiquitination regulation factor1, Smurfl)是一種HECT型泛素連接酶,可以介導多種蛋白的泛素化降解。作為Smadl相互結合蛋白,Smurfl在1999年首次被發(fā)現(xiàn),隨后的研究發(fā)現(xiàn)Smurf1可以通過介導Smad1/5、TGF-βR、RhoA、MEKK2、Rrickle1、 JunB等多種信號分子的泛素化降解來調節(jié)轉化生長因子β(Transforming growth factor, TGF-β)信號通路。雖然Smurfl在TGF-β信號通路中的作用已經(jīng)被很好的闡釋,但是Smurfl在其他信號通路尤其是在免疫反應中的作用還不清楚。最近有兩篇文獻報道了Smurfl在免疫系統(tǒng)中的作用：Smurfl可以介導在免疫反應中起重要作用的TRAFs發(fā)生泛素化降解；Smurfl與Smurf2、Smad6形成一個復合物,通過介導髓樣分化因子88(Myeloid differentiation primary response gene88, MyD88)的泛素化降解負向調節(jié)Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)信號通路。 為了研究Smurfl在免疫反應中的作用,我們探討了Smurfl對IFNs信號通路的影響,并闡述了其分子機制。 研究方法 1.利用Smurfl過表達質粒轉染小鼠單核巨噬細胞RAW264.7,通過雙熒光素酶報告基因(Dual-Luciferase reporter assay system, DLR)的方法檢測Smurfl對IFN-y誘導GAS-luc報告基因活化的影響,以及Smurfl對誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS;也被稱作Nos2)啟動子活性的影響。 2.利用Smurfl特異性的siRNA轉染小鼠原代腹腔巨噬細胞,通過熒光定量PCR (qRT-PCR)的方法檢測Smurfl對(?)Jos2、Irf1、 Cxcl9、Cxcl10、Ly6e、Ifi203等IFNs目標基因表達的影響。 3.利用免疫共沉淀(Co-IP)、免疫熒光(IF)等技術研究Smurfl(?)(?)STAT1的相互作用；利用Smurfl的截斷突變體和STAT1的點突變體尋找介導Smurfl和STAT1發(fā)生相互作用的結構域或基序。 4.利用質粒共轉染和體內(nèi)泛素化實驗探討Smurfl對STAT1蛋白水平及泛素化水平的影響；利用STAT1的磷酸化位點突變體探討Smurfl介導STAT1泛素化與STAT1磷酸化的關系。 5.利用病毒感染及病毒空斑實驗研究Smurfl在IFN-y介導的抗病毒免疫反應中的作用。 6.分別用IFN-y和IFN-p刺激RAW264.7、(?)鼠原代腹腔巨噬細胞、NIH3T3. HEK293等不同細胞,通過Western blot的方法檢測IFNs對Smurfl表達的影響。 結果 1. Smurfl負向調控IFNs信號 為了研究Smurfl在免疫反應巾的作用,我們首先探討了Smurfl對IFNs信號的影響。為了研究Smurfl對IFNs信號的影響,我們先檢測了Smurfl過表達對IFN-γ誘導的GAS-luc(?)(?)告基因的影響。通過雙熒光素酶報告基因實驗,我們發(fā)現(xiàn)：高表達Smurfl能顯著的抑制IFN-y誘導的GAS-luc(?)(?)告基因的活性,而且這種抑制作用隨著Smurfl表達量的增加而更加顯著。同時,我們還檢測了Smurfl對IFN-γ目標基因iNOS啟動了活性的影響,Smurfl同樣可以顯著的抑制iNOS啟動了報告基因的活性。 為了更加直接的研究Smurfl對IFN-γ誘導基因表達的影響,我們利用Smurfl特異性的siRNA沉默小鼠原代腹腔巨噬細胞中Smurfl的表達,然后通過qRT-PCR檢測IFN-y目標基因的表達。我們發(fā)現(xiàn)：當Smurfl被沉默之后,IFN-y誘導的Nos2、Irf1、Cxcl9和Cxc110的表達都顯著升高。與之類似,當Smurfl被沉默之后,IFN-β誘導的Cxcl9、Cxcll1、Ly6e和Ifi203的表達也都顯著增強。這些結果提示我們：Smurfl可以負向調節(jié)IFNs信號通路。 2. Smurfl可以與STAT1發(fā)生組成性結合 Smurfl可以同時抑制IFN-β信號和IFN-y信號,而IFN-β信號和IFN-γ信號下游一個重要的共同分子就是STAT1。而且,之前的相互作用組學研究預測了Smurfl和STAT1可以相互結合。因此,我們提出假設：Smurfl通過靶向STAT1進而負向調節(jié)IFNs信號。 為了證實Smurfl與STAT1可以發(fā)生相互作用,我們將Smurfl和STAT1的過表達質粒轉入HEK293細胞中,然后分別用相應的抗體做Co-IP和Western Blot。結果發(fā)現(xiàn)：外源性的Smurfl和STAT1可以發(fā)生相互結合。然后,我們在小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞中證實：內(nèi)源性的Smurfl可以不依賴于IFNs的刺激與內(nèi)源性的STAT1發(fā)生組成性的結合。 之前大量的研究報道了Smurfl主要是通過其WW結構域與底物蛋白富含脯氨酸的PY基序發(fā)生相互結合。為了尋找Smurfl中介導其與STAT1發(fā)生相互結合的結構域,我們將Smurfl的各種截斷突變體與全長STAT1質粒共轉染入HEK293中,Co-IP和Western Blot的實驗結果發(fā)現(xiàn)：Smurfl通過其WW結構域與STAT1的發(fā)生相互結合。對STAT1的氨基酸序列進行分析,我們發(fā)現(xiàn)STAT1的663位至666位氨基酸序列為PLKY,形成了潛在的PY基序。為了確定STAT1是否是通過其PY基序與Smurfl發(fā)生相互結合的,我們構建了PY基序突變體,并將其與Smurfl過表達質粒共轉染HEK293。Co-IP和Western Blot的實驗結果發(fā)現(xiàn)：PY基序發(fā)生突變的STAT1失去了與Smurfl結合的能力。這些結果提示我們:Smurfl可以通過WW結構域與STAT1的PY基序發(fā)生組成性的結合。 3. Smurfl介導STAT1的泛素化降解 Smurfl是一種可以介導多種分了發(fā)生泛素化降解的泛素連接酶,而且Smurfl可以與STAT1發(fā)生相互結合的,這就促使我們?nèi)パ芯縎murfl對STAT1降解的影響。我們將STAT1過表達質粒與不同量的Smurfl野生型過表達質�；騍murfl泛素連接酶活性位點突變體質粒共轉染入HEK293細胞中,Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)：野生型Smurfl過表達可以顯著降低STAT1的蛋白水平,而Smurfl泛素連接酶活性位點突變體對STAT1的蛋白水平?jīng)]有影響。與之類似,Smurfl過表達可以顯著降低內(nèi)源性STAT1的蛋白水平。為了在生理條件下研究Smurfl對STAT1的影響,我們利用Smurfl特異性的siRNA將小鼠原代腹腔巨噬細胞巾Smurfl沉默,Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)：轉染Smurfl特異性siRNA組的STAT1蛋白水平明顯比轉染陰性對照siRNA組高。這些結果提示我們：Smurfl可以影響STAT1的蛋白水平,而且這種影響與其泛素連接酶活性有關。 Smurfl作為一種泛素連接酶可以降低STAT1的蛋白水平,因此,我們提出假設：Smurfl可以介導STAT1發(fā)生泛素化降解。為了驗證我們的假設,我們首先利用體內(nèi)泛素化實驗檢測了Smurfl對STAT1泛素化的影響。我們發(fā)現(xiàn)：在野生型Smurfl存在的情況下,STAT1的泛素化水平明顯升高,而Smurfl泛素連接酶活性位點突變體對STAT1的泛素化水平?jīng)]有影響。大量研究表明：不同的蛋白分了可以發(fā)生不同形式的泛素化,而泛素化的形式?jīng)Q定了蛋白分了不同的命運。接下來,我們利用泛素突變體和體內(nèi)泛素化實驗研究了Smurfl介導STAT1發(fā)生泛素化的形式。實驗結果表明:Smurfl可以顯著增加STAT1K48位的聚泛素化,而對STAT1K63位聚泛素化沒有影響。之前的研究表明：發(fā)生K48位聚泛素化的蛋白可以被26S蛋白酶體所識別并降解。與之一致,我們發(fā)現(xiàn)26S蛋白酶體抑制劑MG132可以消除Smurfl對STAT1蛋白水平的影響。這些實驗結果證明：Smurfl可以介導STAT1發(fā)生K48位的聚泛素化,并被26s蛋白酶體識別降解。 4. Smurfl介導STAT1的泛素化不依賴于STAT1的磷酸化 STAT1的Tyr701和Ser727磷酸化對于STAT1發(fā)揮其轉錄激活作用起著非常重要的作用。之前有研究報道,泛素連接酶SLIM介導STAT1泛素化降解依賴(?)STAT1的磷酸化。Smurfl介導STAT1的泛素化是否依賴于STAT1的磷酸化呢?為了回答這個問題,我們構建了STAT1磷酸化位點突變體,將其與不同量的Smurfl過表達質粒共轉染入HEK293細胞,Western Blot檢測結果發(fā)現(xiàn)：過表達Smurfl可以降低野生型STAT1和STAT1磷酸化位點突變體的蛋白水平。與之一致,體內(nèi)泛素化實驗結果社示：過表達Smurfl可以增加野生型STAT1和¨STAT1磷酸化位點突變體泛素化水平。這些實驗結果證明：Smurfl介導STAT1發(fā)生泛素化降解不依賴于STAT1的磷酸化。 5. Smurfl負向調節(jié)抗病毒免疫反應 IFNs對于機體抵抗病毒感染發(fā)揮著非常重要的作用,而Smurfl是IFNs信號的一種抑制因子。因此,我們推測Smurfl可能會在機體抵抗病毒感染的過程中發(fā)揮一定的作用。為了探討Smurfl對IFN-y介導的抗病毒反應的影響,我們用VSV病毒感染高表達Smurfl的HEK293細胞和沉默Smurfl的小鼠原代腹腔巨噬細胞,然后利用病毒空斑實驗和實時定量PCR檢測病毒的復制情況。病毒空斑實驗表明：轉染野生型Smurfl組細胞上清巾病毒滴度明顯高于轉染空質粒組,而轉染Smurfl泛素連接酶活性位點突變體組細胞上清巾病毒滴度相對于空質粒組沒有明顯變化。同樣的,轉染野生型Smurfl的HEK293細胞中VSV的RNA復制數(shù)明顯高于轉染空質粒和泛素連接酶活性位點突變體組。為了進一步驗證Smurfl在生理情況下的抗病毒作用,我們用Smurfl特異性的siRNA轉染小鼠原代腹腔巨噬細胞并用IFN-γ刺激,然后用VSV病毒感染。病毒空斑實驗表明,沉默Smurfl的表達顯著降低了巨噬細胞上清巾的病毒滴度。qRT-PCR的結果同樣表明,沉默Smurfl的表達顯著降低了巨噬細胞內(nèi)VSV的RNA復制數(shù)。這些結果提示我們：Smurfl可以負向調節(jié)細胞的抗病毒免疫反應。 6. IFN-y誘導Smurfl的表達 前面實驗研究了Smurfl對IFNs信號的影響,接下來我們探討IFNs對Smurfl表達的影響。我們用IFN-β、IFN-y刺激RAW264.7、小鼠原代腹腔巨噬細胞、NIH3T3、HEK293等不同細胞,通過Vestern blot的方法檢測IFNs對Smurfl表達的影響。實驗結果表明：IFN-γ可以在RAW264.7.小鼠原代腹腔巨噬細胞、NIH3T3、HEK293等多種細胞中誘導Smurfl的表達,而IFN-β對無法誘導Smurfl的表達。 結論 1.泛素連接酶Smurfl可以通過介導STAT1的泛素化降解負向調控IFNs信號。 2. Smurfl可以通過其WW結構域和STAT1的PY基序與STAT1組成性結合,進而介導STAT1發(fā)生K48位的聚泛素化,并被26S蛋白酶體識別降解。 3. Smurfl可以負向調節(jié)細胞的抗病毒免疫反應。 4. IFN-y可以誘導Smurfl的表達,Smurfl形成一種反饋調節(jié)機制調控IFN-γ信號轉導。 創(chuàng)新性和意義 1.本研究首次發(fā)現(xiàn)了HECT型泛素連接酶Smurfl可以負向調節(jié)IFNs信號通路,豐富了我們對Smurfl在免疫反應中的作用的理解。 2.在本研究中,我們闡明了Smurfl抑制IFNs信號的一種可能的分了機制。我們明確了STATl作為一個新的靶點,可以被Smurfl識別并發(fā)生泛素化。這個發(fā)現(xiàn)拓寬了Smurfl的底物譜,同時也證明了機體中除了SLIM存在另一種泛素連接酶可以介導STAT1發(fā)生泛素化。 3.之前的研究發(fā)現(xiàn)由SLIM介導的STAT1泛素化依賴于STAT1磷酸化,有趣的是我們發(fā)現(xiàn)STAT1的磷酸化對Smurfl介導STAT1泛素化并不是必須的,因此Smurfl可能是STAT1在整體水平上的一種調節(jié)因子。 4.本研究發(fā)現(xiàn)IFN-y可以誘導Smurfl的表達,Smurfl進而通過介導STAT1的泛素化降解來負向調節(jié)IFN-y信號,揭示了一種新的IFN-y信號負反饋調節(jié)機制。 局限性 1.本研究雖然發(fā)現(xiàn)了Smurfl可以介導STAT1發(fā)生泛素化降解,但是沒能明確STAT1的泛素化位點。 2. IFNs不僅具有抵抗病毒復制作用,其在免疫調節(jié)方面也具有非常重要的功能,Smurfl是否通過影響IFNs信號參與免疫調節(jié),這需要進一步的研究。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392

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