【摘要】： 腦紅蛋白是新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)特異的攜氧蛋白。已有研究表明腦紅蛋白能夠保護(hù)神經(jīng)元免受缺氧損傷。由于腦紅蛋白是以獨(dú)特的六配體形式存在，氧結(jié)合和解離時(shí)會導(dǎo)致其構(gòu)象變化，甚至可能影響到與其他蛋白的相互作用，因此NGB很可能作為氧感受器，啟動調(diào)節(jié)缺氧相關(guān)蛋白的活性的信號傳導(dǎo)通路，保護(hù)細(xì)胞。為了探討腦紅蛋白作用的分子基礎(chǔ)，本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)從人胎腦cDNA文庫中篩選與其有相互作用的蛋白。序列分析表明，酵母雙雜交篩選得到的一個(gè)陽性克隆的編碼產(chǎn)物與Na~+，K~+-ATPaseβ2亞基(NKA1b2)的C端序列一致。NGB的系列缺失體與NKA1b2亞基C端序列的共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明N端15個(gè)氨基酸是NGB與β2亞基結(jié)合所必需的。隨后采用PCR方法從人胎腦cDNA文庫中擴(kuò)增獲得NKA1b2全長cDNA。GST-pull down實(shí)驗(yàn)表明，原核表達(dá)的NGB與體外轉(zhuǎn)錄翻譯得到的NKA1b2在細(xì)胞外有結(jié)合作用。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明二者在生理?xiàng)l件下能夠以復(fù)合物的形式存在。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明NGB與β2亞基在神經(jīng)元內(nèi)存在共定位。體外實(shí)驗(yàn)表明NGB可以抑制Na~+，K~+-ATPase的活性，具有顯著的量效關(guān)系。缺氧應(yīng)激條件下NGB表達(dá)被上調(diào)1～2倍，NGB與β2亞基的相互作用仍然存在，β2亞基的表達(dá)不受缺氧調(diào)控。據(jù)量效關(guān)系推算，Na~+，K~+-ATPase的活性被抑制10％左右。由于Na~+，K~+-ATPase是腦組織中ATP的主要消耗者之一，在缺氧早期輕度抑制其活性，可以節(jié)省能耗，降低對氧的需求，提高細(xì)胞抗缺氧的能力。因此本研究結(jié)果提示缺氧誘導(dǎo)的NGB能一定程度地抑制Na~+，K~+-ATPase的活性，保護(hù)細(xì)胞免受缺氧損傷。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R363
【圖文】：

BKT7一NGB在酵母菌inYeastAHl09transfo一’molAH109:2:AH109tranAHIOgtransformedwith測化子涂于培養(yǎng)基S果NGB自身有結(jié)果見Tab.1.1，由二T印八Ade漢一Gal平板體是作為陰性對照。1NGB轉(zhuǎn)錄激活活性的sayontranseriPtionalaet

腦紅蛋白(NGB)作用的分子基礎(chǔ)及其在腦缺氧紅素結(jié)合區(qū)域的正確折疊，將增強(qiáng)其與pZ亞基16一151)l一151)1一151)6一151)1一135)1·110)1·90)l一75)2.2NGB系列缺失體與NKA!b2之間的相月_作用lleinteraetionbetweenNGBtruncated一nutantsandNKAlberaetion，“++，，showsthestronginteraction，“一，，showsnoint16

腦紅蛋白(NGB)作用的分子基礎(chǔ)及板劃線，挑取單克隆，進(jìn)行原核表達(dá)。，0.5mM，l.omM)，分別于300C和37oC誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，盡管GsT一NGB主要是以ST一NGB存在，能夠滿足蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的操作過程中，關(guān)鍵的一步是GST們進(jìn)一步取可溶表達(dá)的上清，進(jìn)行蛋子量為26kD，NGB的分子量為16kD，化得到的蛋白大小與理論值相當(dāng)，而且T，這是蛋白表達(dá)過程中翻譯提前中止產(chǎn)需驗(yàn)證GST與NKAlbZ的作用。2345

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 葉紅,金咸tb;低氧誘導(dǎo)因子-1的結(jié)構(gòu)、功能、調(diào)節(jié)及其與低氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2001年01期

2 胡維,向華,周艷,劉敬忠;用PCR法直接快速篩查重組陽性克隆[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2000年01期

3 鄧美玉,張成崗,王春麗,王航雁,周婉瓊;大鼠缺氧缺血性腦損傷腦組織中腦紅蛋白基因表達(dá)的變化[J];中華病理學(xué)雜志;2002年03期

本文編號：2756444