【摘要】：目的：腦缺血損傷可誘發(fā)強(qiáng)大的免疫炎癥反應(yīng)。免疫系統(tǒng)與缺血的腦組織之間的相互作用參與了腦中風(fēng)的病理形成,因而成為了中風(fēng)治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。近期的研究提示CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+regulatory T cells, Tregs)作為一種自身的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞,其功能障礙可加重腦缺血后的腦損傷,因此可能是機(jī)體對(duì)抗腦缺血損傷后腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的一種內(nèi)源性的自身保護(hù)機(jī)制。然而,目前尚未有研究對(duì)外源性給予調(diào)節(jié)性T細(xì)胞靜脈移植輸注是否可對(duì)腦缺血損傷起到保護(hù)作用進(jìn)行過(guò)評(píng)估。故本研究擬1)明確調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的靜脈移植輸注在嚙齒類(lèi)動(dòng)物腦缺血模型中的神經(jīng)保護(hù)作用；2)探討潛在的細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制。 方法：免疫磁珠雙重選擇細(xì)胞提取法提取健康成年C57BL/6J小鼠及SD大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。線(xiàn)栓法制備小鼠及大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型,缺血60分鐘(小鼠)或120分鐘(大鼠)后再灌注。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組(Sham)、腦梗死組(MCAO),腦梗死組又分為靜脈輸注PBS組,靜脈輸注脾細(xì)胞(splenocytes, Sp)組和靜脈輸注調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)治療組。分別于術(shù)后24h和72h對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià),并在MCAO后3天,7天及28天對(duì)腦切片進(jìn)行TTC染色或MAP2免疫組化染色,計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量腦梗死體積。各組動(dòng)物于靜脈輸注調(diào)節(jié)性T細(xì)胞24h以及72h后經(jīng)心臟取血并灌注后取腦制備腦組織冰凍切片,用免疫組織化學(xué)方法染色檢測(cè)外周免疫細(xì)胞在腦組織中的浸潤(rùn)。用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血漿基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、 TGF-β表達(dá)水平的變化。為進(jìn)一步探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用,我們聯(lián)合采用了Gr-1抗體特異性消除中性粒細(xì)胞,MMP-9基因敲除以及骨髓嵌合子技術(shù)以及體外Treg與中性粒細(xì)胞的共培養(yǎng)技術(shù)。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析外周免疫細(xì)胞評(píng)估Treg治療對(duì)于全身免疫功能的影響。 結(jié)果：在小鼠局灶性腦缺血模型中,MCAO后2、6或24小時(shí)后靜脈輸注提純的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可減少腦缺血后的腦梗死面積約50%,對(duì)神經(jīng)功能的改善可持續(xù)至MCAO后28天。MCAO后2小時(shí)給予Treg靜脈輸注治療具有最顯著的治療效果,且在大鼠腦缺血模型中也具有保護(hù)作用。值得一提的是腦缺血后Treg的有效治療窗可長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)。在腦缺血后1天,腦內(nèi)炎癥反應(yīng)、外周炎癥細(xì)胞在損傷區(qū)腦組織內(nèi)的浸潤(rùn)以及血腦屏障的破壞顯著減輕。 應(yīng)用CD45.1的同類(lèi)系小鼠以及細(xì)胞示蹤技術(shù),我們驚喜地發(fā)現(xiàn)Treg的神經(jīng)保護(hù)作用并不需要其浸潤(rùn)至腦組織內(nèi)或抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,提示其可能在外周循環(huán)中發(fā)揮保護(hù)作用。應(yīng)用Gr-1抗體中和消除體內(nèi)中性粒細(xì)胞,基因敲除MMP-9或?qū)MP-9基因敲除的骨髓轉(zhuǎn)移至野生型經(jīng)照射的小鼠體內(nèi)都可消除Treg的神經(jīng)保護(hù)作用,顯示Treg是通過(guò)抑制外周中性粒細(xì)胞來(lái)源的基質(zhì)金屬蛋白酶-9的產(chǎn)生,從而防止了血腦屏障的破壞。Treg與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)的體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了Treg是通過(guò)細(xì)胞間相互接觸的方式抑制中性粒細(xì)胞的MMP-9產(chǎn)生的。除了中樞神經(jīng)保護(hù)作用以外,Treg治療還顯示出對(duì)中風(fēng)后低淋巴血癥具有緩解作用,提示此治療有望改善中風(fēng)后的免疫狀態(tài)。 結(jié)論：本研究提示CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞靜脈輸注移植是一種以中風(fēng)后免疫功能紊亂為靶點(diǎn)的創(chuàng)新而有效的細(xì)胞治療方法。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞輸注移植治療通過(guò)抑制外周中性粒細(xì)胞MMP-9的產(chǎn)生保護(hù)了血腦屏障從而達(dá)到了早期的神經(jīng)保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R743.3;R-332
【圖文】：

Treg治療改善二

1E)并減輕了神經(jīng)功能的缺失（圖IF)。而經(jīng)Sp或PBS處理的兩組小鼠腦缺血后在腦梗死體積以及腦炎癥反應(yīng)方面并無(wú)顯著差異（圖3)。因此，在我們后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，選擇了 Sp處理組作為T(mén)reg治療的對(duì)照組。A B C-150 ns 1 160 ns ns ^ i50 ^l:||rCTX SIR CTX STR CTX STRO)TO 200 "I 扁 20 ns言 i 4福 i 15 rnil:V - PBS sp圖3脾細(xì)胞對(duì)照組與PBS對(duì)照組腦內(nèi)炎癥反應(yīng)與BBB滲漏程度相當(dāng)(A-C) PBS處理或脾細(xì)胞處理組小鼠腦內(nèi)MPO陽(yáng)性的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（A)、F4/80陽(yáng)性的巨唾細(xì)胞浸潤(rùn)（B)以及CD3陽(yáng)性的T細(xì)胞浸潤(rùn)計(jì)數(shù)（n=4/組）。（D) MCAO后24小時(shí)，real-time PCR測(cè)定各組小鼠缺血側(cè)半腦內(nèi)丨1_-1口，IL-6, IL-17andTNF-a的mRNA表達(dá)（n=4/組）。（E)通過(guò)計(jì)算小鼠丨gG免疫組化18

1 <^ays 28 days圖4 Treg治療對(duì)腦缺血損傷起到了長(zhǎng)期的神經(jīng)功能保護(hù)作用在MCAO后2小時(shí)，受有小鼠分別接受Treg或脾細(xì)胞靜脈輸注移植。在MCAO G對(duì)腦梗死大小以及感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，直到MCAO in 28天。（A-B)角落實(shí)驗(yàn)（A，n=10/組）以及前肢放置實(shí)驗(yàn)（B，n=10/組）發(fā)現(xiàn)缺血后1-7天的急性感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能損傷在Treg處理組小鼠中有a著改善。角落實(shí)驗(yàn)的結(jié)果用19

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Minocycline inhibits 5-lipoxygenase activation and brain inflammation after focal cerebral ischemia in rats[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年06期

本文編號(hào)：2755931