【摘要】：金黃色葡萄球菌(金葡菌)是人類主要的病原菌,它能引起肺炎、骨髓炎、心內(nèi)膜炎及敗血癥等多種感染性疾病。隨著各種廣譜抗菌藥物在臨床的大量不合理使用,導致金葡菌對抗生素高度耐藥,造成臨床治療上的困難及病死率增高,嚴重威脅人類健康。因此,在合理使用抗生素的同時,也迫切需要開發(fā)與傳統(tǒng)抗生素作用模式不同的新型抗菌藥物。 溶葡萄球菌酶是一種由模仿葡萄球菌分泌的肽聚糖水解酶,能高效裂解金葡菌細胞壁。目前,它作為新型抗菌劑已進入臨床研究用于治療創(chuàng)面金葡菌感染。該酶由兩個結構域組成：N-端催化結構域(催化區(qū))和X-端細胞壁結合結構域(結合區(qū))。在蛋白結構數(shù)據(jù)庫(PDB)中,目前只有上述兩個結構域同源類似物的晶體結構,即LytM(金葡菌分泌的一種自溶酶)的催化區(qū)(PDB:2B13)和ALE-1(頭狀葡萄球菌分泌的一種肽聚糖水解酶)的結合區(qū)(PDB:1R77),它們與溶葡萄球菌酶的催化區(qū)和結合區(qū)分別具有63%和89%的相似性。然而,至今還未見溶葡萄球菌酶晶體結構的報道。 為了研究溶葡萄球菌酶如何高效裂解細菌細胞壁肽聚糖,我們展開了系列研究。首先,分別表達和純化溶葡萄球菌酶及其兩個結構域,并且檢測了它們的生物活性,發(fā)現(xiàn)單獨催化區(qū)在低鹽濃度下具有很強的溶菌活性,但其活性隨離子強度的上升而顯著下降,當環(huán)境中NaCl濃度提高至50mM時,它的溶菌活性只有原來的1%；然而全長溶葡萄球菌酶的溶菌活性受離子強度的干擾非常小；單獨結合區(qū)具有與金葡菌非常強的親和力,與催化區(qū)不同的是,即使在生理鹽濃度(150mM NaCl)下,結合區(qū)還保持很強的親和力,說明結合區(qū)和催化區(qū)的組合可以顯著提高溶葡萄球菌酶的溶菌活性,并耐受環(huán)境(比如鹽離子)的影響。 為進一步了解兩個結構域是如何組合在一起發(fā)揮高效溶菌活性,我們用同源模建的方法,構建了溶葡萄球菌酶催化區(qū)和結合區(qū)的三維結構模型,并通過蛋白-蛋白分子對接方法,計算預測溶葡萄球菌酶兩個結構域之間的對接方式,發(fā)現(xiàn)在自由能最低的前20個結構中,溶葡萄球菌酶兩個結構域之間沒有特定的相互作用界面,催化區(qū)隨機分布在結合區(qū)的各個方位,說明計算方法并不適合預測溶葡萄球菌酶兩個結構域之間對接模型。 隨后,我們用實驗的方法鑒定溶葡萄球菌酶兩個結構域之間的相互作用界面,應用氫氘交換質(zhì)譜法比較全長溶葡萄球菌酶和它兩個結構域之間氫氘交換率的變化,發(fā)現(xiàn)了4個肽段(aa.331-339、248-260、454-473和474-488)的氫氘交換率在全長溶葡萄球菌酶中變慢,表明這些肽段可能參與溶葡萄球菌酶兩個結構域之間相互作用界面的形成。為了驗證哪些肽段確實參與界面的形成,我們通過位點特異二硫鍵交聯(lián)方法分析肽段之間的交聯(lián)反應,發(fā)現(xiàn)有兩個雙半胱氨酸突變體(K332C/T464C和K336C/T464C)能夠很好的形成二硫鍵,它們的突變位點分別位于肽段331-339(催化區(qū))和肽段454-473(結合區(qū))上,證明這兩個肽段在全長溶葡萄球菌酶分子中緊靠在一起,說明溶葡萄球菌酶的兩個結構域在溶液中通過這兩個肽段相互作用形成了結構域之間的界面,此時催化區(qū)和結合區(qū)的活性中心處于同一個平面,有利于它們同時與底物結合。 為了研究二硫鍵的形成對突變體(結構域之間受到限制)生物活性產(chǎn)生的影響,我們比較了突變體(K332C/T464C)和野生型溶葡萄球菌酶與金葡菌細胞壁的親和力以及它們的溶菌活性。發(fā)現(xiàn)結構受限的突變體與金葡菌細胞壁的親和力沒有改變,然而溶菌活性顯著下降,尤其是在高鹽環(huán)境下。為了確認是二硫鍵產(chǎn)生的影響,我們用DTT打開突變體分子中的二硫鍵,消除兩個結構域之間的限制,發(fā)現(xiàn)它的溶菌活性又完全恢復,提示溶葡萄球菌酶兩個結構域之間在一定范圍內(nèi)可以相對運動是該酶高效裂解細菌細胞壁的一個重要因素。 之前研究人員已經(jīng)證明肽聚糖是一個具有彈性的網(wǎng)狀結構,在不同離子強度條件下可以收縮或者伸展。當環(huán)境鹽濃度升高,細菌細胞壁收縮,肽聚糖變得松散和無規(guī)則,溶葡萄球菌酶兩個結構域之間的動力學特點可以幫助催化區(qū)迅速調(diào)整位置,結合并水解細胞壁上的底物,從而實現(xiàn)高效裂解細菌細胞壁。 本研究有助于我們更好地理解溶葡萄球菌酶高效裂解細菌細胞壁的作用機制。根據(jù)獲得的結構信息,進一步可以選擇合適的位點進行聚乙二醇修飾,獲得具有良好體內(nèi)藥效學和藥代動力學性質(zhì)的聚乙二醇化溶葡萄球菌酶,從而擴大臨床應用范圍和提高療效。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.11
【圖文】：

Baba等I26】研究表明溶葡萄球菌酶分子中C-端結合區(qū)，可以將溶葡萄球菌酶特異性祀向金葡菌（圖1.5)，對該酶特異性識別金葡菌起到關鍵的作用。進一步研究表明，溶葡萄球菌酶的結合區(qū)只結合處于交聯(lián)狀態(tài)下的五甘氨酸肽鍵橋Gargis等丨28】研究表明金葡菌細胞壁肽聚糖五甘氨酸肽鍵橋的突變并沒有完全抑制結合區(qū)與金葡菌的結合。這些研究結果表明溶葡萄球菌酶結合區(qū)祀向金葡菌細胞依賴于細菌細胞壁肽聚糖中的多個結構元素。目前溶葡萄球菌酶的晶體結構依然沒有獲得，它的高效溶菌機制和特異性IE向機制還有待進一步研究。?Gn_Mu -Gn—Mu -Gn—Mu—GnA/IL-AlaID-iGInI ^L-Lys i i D-Ala “I i 1 I iD-A!a—Gly Gly Gly Gly Gly _L-Lys ^(cross-bridge) ■ 芒D-iGIn，I —?i CLL嚴?Gn—Mu -Gn—Mu "-Gn—Mu "<3nA/(Polysaccharide chain)圖1. 4金葡菌肽聚糖的主要成分和溶葡萄球菌酶的作用位點(箭頭標示)示意圖3

）) (PDB: 1R77)(圖i.iob)。CAT結構域的活性中心由一個狹長的四槽WT結構域屬于細菌SH3b家族，負責細菌細胞壁的識別，研究人員通過突變分析了它的活性中心區(qū)域11()3]。

圖1.10a金葡菌自溶酶LytM催化區(qū)的 圖1. 10b頭狀葡萄球菌肽聚糖水解酶晶體結構 ALE-1細菌細胞壁結合區(qū)的晶體結構 CAT domain Lysostaphin 248 :AATHeHSAQm:*mYKRO7(3YGP7FLGXNG0MHY<3VDFFMtT工(3rFVKAZSSGKXVEA0WSIT709(aVQI<aLIS3DaVHRQWXMHI*Sl^Ale-1 119 ： AAQS2!mSASWI^THYKKG3:SYGpyPI>GXNOramYGrVDFn4MVI3TFVKAISDOKXVEACIVmTZOOarEiaLVENDSVHRQWXHKLSKLytM 182 : ASGHAKDASWI.TSKKQI.QPYOQ'THG OaAHXGFVDYAMPEHSEVXSLTDGTWQAGKSNYOGaNQVTIKEANSinTYQWZMHNITR? * * * * ； * * ** *?*■** ： ? I ** * ；*；*** ****** * ***** Linker %

本文編號：2754937