【摘要】：目的：破骨細胞是骨吸收的主要功能細胞,由造血系統(tǒng)的單核-巨噬細胞系分化而來,在生理和病理性骨代謝中發(fā)揮著重要的作用。許多疾病狀態(tài)下,破骨細胞的形成和功能受到影響,導致骨吸收異常的病理狀態(tài)。體內(nèi)破骨細胞分化是一個復雜的過程,其機制尚未完全明了。以刺激因子體外誘導骨髓單核細胞向破骨細胞分化是研究破骨細胞分化機制的有效方法,本實驗分離培養(yǎng)原代小鼠骨髓單核細胞,并以不同濃度刺激因子誘導,建立后續(xù)試驗應用的小鼠原代骨髓單核細胞(BMMs)體外培養(yǎng)體系。 方法：取小鼠原代全骨髓細胞,在含有50ng/ml M-CSF的骨髓單核細胞培養(yǎng)基中37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h,利用差異貼壁方法去除骨髓基質(zhì)細胞,取未貼壁的細胞懸液,再利用單核細胞分離液分離出純度較高的骨髓單核細胞。以不同濃度RANKL體外誘導單核細胞向破骨細胞分化,于不同時間點觀察各組細胞分化狀態(tài),培養(yǎng)72h時終止誘導,行TRAP染色,觀察比較誘導終點時不同濃度RANKL誘導組破骨細胞分化程度及破骨細胞計數(shù)。 結果：分離所得骨髓單核細胞呈貼壁生長,均勻分布,形態(tài)較為均一,多為圓形、多角形,少數(shù)為長梭形,細胞體積較小。本實驗采用50ng/ml M-CSF及兩種濃度小鼠重組RANKL分別誘導:1ng/ml和lOng/ml。結果顯示,在誘導早期(24h),兩組細胞生長狀態(tài)大致相同,形態(tài)較為均一,細胞多為圓形及多角形,少量單核細胞呈TRAP染色陽性,均未見多核細胞生成。兩組細胞均于誘導48h開始出現(xiàn)體積較小的TRAP陽性多核細胞,形態(tài)、體積及數(shù)目無明顯差異。直至誘導晚期(72h),兩組細胞分化狀態(tài)才出現(xiàn)區(qū)別：10ng/mlRANKL刺激組TRAP陽性多核細胞數(shù)量更多、體積更大,胞漿更為伸展；而1ng/mlRANKL刺激組TRAP陽性多核細胞體積則比較小,形狀多為毛刺狀或油烈蛋樣。 結論：M-CSF的作用下全骨髓細胞于37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時,此時收集未貼壁細胞,是利用BMMs在M-CSF作用下貼壁時間長于骨髓基質(zhì)細胞而進行的第一次純化,將收集的未貼壁細胞經(jīng)過單核細胞分離液梯度離心半小時,根據(jù)不同細胞密度的差異,取中間部分白膜層進行單核細胞第二次純化,用此方法便可以分離出形態(tài)較為均一、純度較高的骨髓單核細胞,可用于后續(xù)試驗。在50ng/mlM-CSF條件下,高濃度(10ng/ml)RANKL較低濃度(1ng/ml)RANKL刺激組誘導破骨細胞生成能力更強,可以增加破骨細胞生成的數(shù)量、體積,并可能提高其骨吸收能力,但是并不能加快誘導破骨細胞生成的速度。后續(xù)試驗可選用1ng/ml RANKL及50ng/ml M-CSF體外誘導破骨細胞分化。 目的：骨穩(wěn)態(tài)一旦被破壞,便會導致多種疾病的發(fā)生。骨吸收功能亢進可導致骨質(zhì)破壞,骨密度降低,如類風濕性關節(jié)炎、自身免疫性關節(jié)炎、骨質(zhì)疏松等,這些疾病大多伴隨有血清或骨關節(jié)局部腫瘤壞死因子(TNF-a)的增高。高水平TNF-α)與全身或局部性骨丟失疾病的發(fā)生有著密切的關系,可直接或間接的促進破骨細胞的生成及功能,但其具體作用機制尚未完全闡明。近年來體外研究證明,TNF-α不直接影響RANK/RANKL近端激活的分子,而是可能通過活化破骨前體細胞內(nèi)鈣離子震蕩,增強NFATc1自放大作用來促進RANKL誘導的破骨細胞生成。體內(nèi)參與該震蕩調(diào)控的分子眾多,TNF-α是通過何種機制實現(xiàn)其對鈣離子震蕩的調(diào)控作用呢?以往文獻報道,ROS和PC-PLC是細胞內(nèi)位于多種TNF-α信號通路下游同時參與介導鈣振蕩形成的兩種重要信號分子,介導了細胞凋亡、炎癥反應等多種細胞事件的發(fā)生。IP3受體是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的一種鈣離子通道,通過結合IP3而活化,介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫和細胞質(zhì)之間的鈣離子交通,是細胞內(nèi)鈣震蕩波形成的重要通道。至今研究發(fā)現(xiàn)主要存在3種IP3受體亞型：IP3R1、IP3R2和IP3R3,其分布有組織和細胞類型特異性。研究顯示,小鼠破骨前體細胞中同時存在上述三種IP3受體。本部分實驗旨在探討ROS、PC-PLC及IP3Rs在TNF-a對鈣離子震蕩調(diào)控過程中的作用,進一步揭示TNF-α促進體內(nèi)外破骨細胞生成的機制。 方法：本研究采用第一部分實驗中建立的破骨細胞體外培養(yǎng)體系,以1ng/ml RANKL和50ng/ml M-CSF誘導小鼠骨髓來源單核細胞,在誘導過程中加入3ng/ml TNF-α刺激。使用DCFH-CA熒光探針檢測細胞內(nèi)不同誘導時間點ROS水平變化,明確ROS在RANKL誘導破骨細胞分化過程中的變化趨勢及加入TNF-α刺激后細胞內(nèi)ROS的變化情況；采用磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(PC-PLC)特異性抑制劑D609探討PC-PLC在TNF-α促進體外誘導破骨細胞生成中的作用。將培養(yǎng)細胞分為誘導對照組、TNF-α刺激組、D609刺激組及TNF-a+D609刺激組四組,施加不同誘導及刺激因子。于培養(yǎng)48h時,激光共聚焦顯微鏡檢測各刺激組細胞內(nèi)鈣離子的震蕩情況,明確各刺激因素對鈣振蕩的影響效果；RT-PCR及western blotting檢測不同處理組三種IP3Rs mRNA及蛋白表達水平,進一步闡述IP3Rs在TNF-α促進RANKL體外誘導破骨細胞生成過程中的作用。 結果：研究中發(fā)現(xiàn),細胞內(nèi)ROS水平在RANKL誘導24h開始升高,并持續(xù)至48h以后,加入TNF-a不能使細胞內(nèi)ROS進一步升高；比較各組TRAP染色陽性多核細胞數(shù)發(fā)現(xiàn),磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(PC-PLC)特異性抑制劑D609抑制了TNF-α對破骨細胞生成的促進作用,但是對RANKL單獨誘導的破骨細胞生成并無抑制,相反輕度促進破骨細胞生成。TNF-α能夠明顯增強小鼠骨髓來源單核細胞中鈣離子通道IP3R1mRNA和蛋白的表達,而不影響IP3R2和IP3R3mRNA水平,提示位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣離子通道IP3R1的上調(diào)可能為其配體IP3提供更多的結合位點,促進細胞內(nèi)鈣震蕩的產(chǎn)生,IP3R1參與TNF-a對RANKL體外誘導破骨細胞生成的促進作用,而IP3R2和IP3R3可能并不參與介導該過程。D609抑制了TNF-a對IP3R1mRNA和蛋白表達的促進作用,降低鈣離子震蕩水平,進而抑制NFATc1活化,同時消除了TNF-α對破骨細胞生成的影響。上述結果表明PC-PLC及IP3R1可能參與TNF-α促進破骨細胞生成的過程之中。 結論：本實驗結果進一步驗證了TNF-α不直接影響RANK/RANKL近端激活的分子,ROS可能介導破骨細胞體外分化,但不參與TNF-α對RANKL誘導破骨細胞生成的促進作用；TNF-α能夠通過活化PC-PLC,上調(diào)IP3R1mRNA和蛋白的表達水平,促進破骨前體細胞內(nèi)鈣庫與細胞漿之間的鈣交通,以增強其鈣離子震蕩,促進NFATc1活化和自放大,最終促進RANKL誘導的破骨細胞生成。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329

【參考文獻】

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1 劉華清;李冰燕;張增利;;四種小鼠破骨細胞體外誘導培養(yǎng)方法的比較[J];環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學;2011年09期

本文編號：2754410