【摘要】：摘要：水通道蛋白3(Aquaporin3, AQP3)是一種能快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水、甘油和尿素等小分子物質(zhì)的膜整合蛋白,在皮膚的屏障功能、水的保存中起重要作用。AQP3不但參與細(xì)胞的增殖、分化與遷移,與皮膚細(xì)胞的衰老相關(guān),而且還能夠通過(guò)調(diào)節(jié)H202的透膜吸收,進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)。 自噬是細(xì)胞內(nèi)主要的異化途徑,維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài),參與衰老以及與衰老相關(guān)的各種生理病理過(guò)程。但隨著年齡的增長(zhǎng),細(xì)胞內(nèi)自噬功能逐漸減弱,導(dǎo)致細(xì)胞適應(yīng)外界環(huán)境和自身防御反應(yīng)的能力降低,細(xì)胞穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化。細(xì)胞光老化過(guò)程中,UVA輻射細(xì)胞產(chǎn)生的ROS可誘導(dǎo)自噬及細(xì)胞衰老,而衰老的細(xì)胞中,自噬功能減弱,ROS對(duì)細(xì)胞造成的損傷得不到清除而不斷積累,進(jìn)一步加重細(xì)胞衰老。而H2O2作為ROS的重要組成成分,可被AQP3跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),由此,我們推測(cè)：AQP3與自噬在NHSFs光老化過(guò)程中可能存在某些聯(lián)系。 本研究的第一部分中,我們首先采用組織塊真表皮分離法原代培養(yǎng)正常人皮膚成纖維細(xì)胞(NHSFs),利用320-400nm波長(zhǎng)范圍的UVA輻射NHSFs,構(gòu)建光老化細(xì)胞模型。再行慢病毒轉(zhuǎn)染AQP3shRNA和AQP3cDNA質(zhì)粒,成功構(gòu)建不同AQP3表達(dá)量的NHSFs穩(wěn)定細(xì)胞株。最后行β-半乳糖苷酶染色、Western-blot (WB)和RT-PCR等技術(shù)檢測(cè)衰老相關(guān)指標(biāo)及光老化過(guò)程中AQP3水平的變化；行透射電鏡、免疫熒光染色(IF)以及Western-blot等技術(shù)檢測(cè)自噬水平。研究發(fā)現(xiàn)：(1)小劑量UVA單次輻射NHSFs,不能誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,但AQP3表達(dá)增高；小劑量UVA重復(fù)5天輻射NHSFs,可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,此時(shí)AQP3表達(dá)下降；(2)降低表達(dá)AQP3的NHSFs出現(xiàn)衰老表型,接受小劑量的UVA單次輻射可加重衰老；而過(guò)表達(dá)AQP3可使NHSFs在接受小劑量UVA重復(fù)5天的劑量輻射時(shí)的衰老減輕；(3)小劑量UVA單次輻射NHSFs,細(xì)胞自噬水平增高；小劑量UVA重復(fù)5天輻射NHSFs,白噬水平下降；(4)降低表達(dá)AQP3的NHSFs,自噬水平降低,小劑量的UVA單次輻射可使自噬水平進(jìn)一步降低；而過(guò)表達(dá)AQP3,使NHSFs的自噬水平增加,在接受小劑量UVA重復(fù)5天的劑量輻射時(shí)的亦可減輕自噬水平的降低。該部分研究初步明確了,AQP3通過(guò)影響細(xì)胞自噬,在人皮膚成纖維細(xì)胞光老化過(guò)程中的發(fā)揮保護(hù)性作用。 為進(jìn)一步明確AQP3通過(guò)影響自噬參與細(xì)胞光老化過(guò)程的具體機(jī)制,在第二部分的研究中,我們利用前期構(gòu)建的光老化細(xì)胞模型和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,使用H2O2抑制劑,以及三條MAPKs途徑中各磷酸化蛋白分子的抑制劑,檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)H2O2水平,以及ERK1/2／、JNK/SAPK、p38MAPK及mTOR磷酸化水平/總蛋白水平以及LC3Ⅱ/Ⅰ和P16INK4a的蛋白表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)：(1)低表達(dá)AQP3的NHSFs,胞內(nèi)H2O2水平增加,低劑量UVA單次輻射即可使胞內(nèi)H2O2水平進(jìn)一步升高,H2O2抑制劑可顯著降低其水平；(2)高表達(dá)AQP3可顯著減少NHSFs在接受低劑量UVA重復(fù)5天輻射時(shí)升高的胞內(nèi)H2O2水平,H2O2抑制劑亦可降低其胞內(nèi)H202水平；(3)抑制劑降低胞內(nèi)H2O2水平后,可使MAPKs的JNK/SAPK、P38MAPK、ERK磷酸化水平下降；(4)分別抑制三種MAPKs磷酸化后,只有JNK/SAPK、p38MAPK抑制劑誘導(dǎo)了LC3Ⅱ/Ⅰ水平增高,P16INK4a表達(dá)下降。說(shuō)明,三條MAPKs途徑中只有JNK/SAPK、p38MAPK途徑參與了AQP3調(diào)節(jié)自噬和影響光老化的過(guò)程；而AQP3介導(dǎo)的H2O2的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),是活化MAPKs途徑的重要因素。 綜上所述,我們得出如下結(jié)論：UVA輻射NHSFs誘導(dǎo)的胞內(nèi)H2O2聚集可激活MAPKs途徑進(jìn)而影響自噬和衰老,AQP3可通過(guò)調(diào)控H2O2的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),減輕MAPKs的活化,實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬水平的調(diào)節(jié),從而抵御NHSFs衰老。即：AQP3可通過(guò)影響ROS-MAPKs-mTOR途徑調(diào)節(jié)自噬,從而在人皮膚成纖維細(xì)胞光老化過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)性作用。本研究首次將AQP3引進(jìn)皮膚衰老機(jī)制的研究領(lǐng)域,也是首次發(fā)現(xiàn)AQP3可通過(guò)影響自噬水平延緩細(xì)胞光老化衰老進(jìn)程。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R339.11
【圖文】：

不同劑量UVA福射NHSFs，衰老表型的鑒定23

劑量UVA單次福射人皮膚成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)AQP3表達(dá)增高5J/cm^x5d UVA福射NHSFs，AQP3表達(dá)下降（圖2a, b)；而SJ/cmbVA輻射NHSFs,AQP3的表達(dá)增強(qiáng)（圖2a，b)。IF結(jié)果可見：正常NHSFs的AQP3主要表達(dá)于胞膜及胞質(zhì)中；5J/c:m2UVA福射NHSFs后48h，AQP3的胞團(tuán)表達(dá)與正常NHSFs比較明顯增強(qiáng)（PcO.OOl)；而5J/cm2x5d UVA福射NHSFs后48h，AQP3的膜菜表達(dá)均不清晰，較正常NHSFs顯著減弱（P<0.01)。[■】 [d】A0P3 —！-}0:00] … 口 NHSFSp-actin 棚^ mmm mmm | - i2kD ；抑- tMOd Kid x2d a4d iSd ^ 60-c "T-|6] 5 40- It **! 1 二 20' 1 —.GAPDH 一452bp ￡！ ^~ ？ 0N""“一I~I一"I~I~’~.~匕AOP^ Zlvvp 、 、 XA。P3 JSWtitr' xld x2d z3d >4d x5d\C]圖2不同劑量UVA福射NHSFs后AQP3的表達(dá)水平2.2.2改變AQP3的表達(dá)量對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)活性的影響2.2.2.1 NHSFs-AQP3shRNA. NHSFs-AQP3cDNA的轉(zhuǎn)染效果鑒定NHSFs-virus和NHSFs-virus’分別與正常對(duì)照組NHSFs比較；NHSFs-AQP3shRNA 組與 NHSFs-virus 組比較；NHSFs-AQP3cDNA 組與NHSFs-virus'比較。WB 結(jié)果顯示：NHSFs 組、NHSFs-virus 組、NHSFs-AQP3shRNA 組、NHSFs-virus’及NHSFs-AQP3cDNA組，分子量為36kd位置處均可見灰度均一的蛋白質(zhì)條帶，提示均有AQP3蛋白表達(dá)；分子量為42kd的內(nèi)參p-Actin條帶清晰，表24

0.05)； (2) NHSFs-AQP3shRNA組較NHSFs-vims組，AQP3表達(dá)水平均明顯降低(P < 0.001)，如圖3Aac所示；（3) NHSFs-AQP3cDNA組較NHSFs-virus’組，AQP3表達(dá)水平顯著升高（P < 0.01)，如圖3Bac所示。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳可見：NHSFs組、NHSFs-virus組、NHSFs-AQP3shRNA組、NHSFs-virus’組及NHSFs-AQP3cDNA組，226bp產(chǎn)物片段位置可見AQP3焚光條帶清晰，452bi)產(chǎn)物片段位置可見GAPDH條帶清晰，表達(dá)均一，無(wú)其它雜帶。其中，以NHSFs組的AQP3突光灰度值作為參照，（1)NHSFs-virus組較NHSFs組

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本文編號(hào)：2754055