【摘要】：目的：探索滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(SMSCs)穩(wěn)定地向纖維軟骨分化的充分必要條件,并在體外實驗中重復(fù)這一過程；進(jìn)而初步探索這一過程調(diào)控的分子機(jī)制。方法：通過貼壁法和有限稀釋技術(shù)得到SMSCs,通過形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、分子表型、細(xì)胞代謝動力學(xué)、多向誘導(dǎo)分化等方法鑒定SMSCs并驗證其穩(wěn)定性、安全性、成軟骨能力、細(xì)胞活性和三向分化潛能等生物學(xué)特征。通過綜述文獻(xiàn)、模擬體內(nèi)環(huán)境等方法,經(jīng)過預(yù)實驗篩選后,使用L60(212)正交試驗探索SMSCs向纖維軟骨分化的充分必要條件；正交試驗以纖維軟骨生成率為因變量,使用RT-PCR方法檢測纖維軟骨細(xì)胞的基因表達(dá),使用甲苯胺藍(lán)等特異染色手段檢測軟骨特異性分子的表達(dá),以計算軟骨生成率。通過反復(fù)試驗和比對探索出SMSCs向纖維軟骨分化并穩(wěn)定表達(dá)的最佳條件后,使用基因芯片的方法檢測這一過程差異表達(dá)的基因�；蛐酒�8697個目的基因來源于文獻(xiàn)綜述,2153個基因序列來源于expressed sequence-tag (EST) library,6,544是根據(jù)NCBI database Genebank數(shù)據(jù)庫證實的基因構(gòu)建,一些基因的開放性閱讀框太短,無法用于基因芯片,最終用于基因芯片檢測的基因有8605個。差異表達(dá)的基因再使用半定量RT-PCR的方法進(jìn)一步驗證。使用Quackenbush的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和背景噪音的消除,使用Eisen的方法進(jìn)行基因芯片數(shù)據(jù)分析,2倍表達(dá)差異作為差異表達(dá)的下限。此后進(jìn)行基因功能分析。最后,針對基因芯片的表達(dá)結(jié)果和實驗中涉及的調(diào)控條件推論TGF β-TGF β receptor-Smad2/3通路和BMP-BMP receptor-Smad1/5/8通路參與SMSCs成纖維軟骨過程中的調(diào)控,使用RT-PCR和Western-Blotting的方法在基因水平和蛋白水平證實纖維軟骨基因和調(diào)控因子間的關(guān)系,使用軟骨特異性染色和特異分子的染色鑒定這些分子在SMSCs誘導(dǎo)分化后的高表達(dá)。結(jié)果：SMSCs具有穩(wěn)定、安全、成軟骨能力強(qiáng)、細(xì)胞活性好、取材方便等特征。在SMSCs成纖維軟骨過程中TGF β1,BMP7, ASA, bFGF, IGF是最重要的調(diào)控因子,通過對這些因子的劑量和時序表達(dá)的改變,可以顯著的影響SMSCs成纖維軟骨的過程。其他細(xì)胞因子與前述因子存在交互,調(diào)控顯著性不及前述因子。除細(xì)胞因子外,機(jī)械環(huán)境氧濃度等亦是重要的調(diào)控作用,通過合理配置這些調(diào)控作用,能夠得到穩(wěn)定的纖維軟骨轉(zhuǎn)化率。基因芯片證實,SMSCs成軟骨過程中,目標(biāo)基因中1361基因差異表達(dá),這些基因并不是持續(xù)高表達(dá),而是隨時間變化不斷調(diào)整表達(dá)豐度。聚類分析顯示,分化第21天的細(xì)胞與原始SMSCs的基因相似程度較高,而分化3、7、14天的細(xì)胞更加相似。主要功能基因的分析顯示無論是SMSCs原代細(xì)胞還是成纖維軟骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞其增殖相關(guān)基因表達(dá)增高顯著,大部分的高表達(dá)基因在這一過程中的作用還不是非常清楚。TGF β-TGF β receptor-Smad2/3通路和BMP-BMP receptor-Smad1/5/8通路是兩條重要的調(diào)控通路,糖濃度和機(jī)械環(huán)境對SMSCs成纖維軟骨的調(diào)控通過前述通路實現(xiàn)。許多調(diào)控通路中涉及大量未知的調(diào)控因子和旁路,即使是已知的通路中仍存在未知的作用。結(jié)論：SMSCs是理想的半月板組織工程種子細(xì)胞來源;合理的培養(yǎng)條件能得到SMSCs穩(wěn)定向纖維軟骨細(xì)胞分化的支架模型；這一過程涉及存在大量差異表達(dá)的基因且多數(shù)功能不清楚值得深入探索；TGF β-TGF β receptor-Smad2/3通路和BMP-BMP receptor-Smad1/5/8通路是兩條重要的基因調(diào)控通路,糖濃度和機(jī)械環(huán)境對SMSCs成纖維軟骨的調(diào)控通過前述通路實現(xiàn)；調(diào)控通路和基因表達(dá)之間關(guān)系復(fù)雜,即有調(diào)控通路下游基因的差異表達(dá),又存在調(diào)控通路本身基因的差異表達(dá),還有已表達(dá)的基因在小干擾RNA作用下降解等問題,深入研究SMSCs成軟骨過程的分子機(jī)制對體外構(gòu)建有生物學(xué)功能的半月板組織至關(guān)重要。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 祝云利 ,荊鑫 ,繆志和 ,吳海山 ,周維江;纖維軟骨細(xì)胞-膠原復(fù)合物修復(fù)半月板損傷的實驗研究[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2002年01期

2 付維力;王踐云;萬昌秀;李箭;;組織工程半月板支架材料研究進(jìn)展[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2010年02期

3 徐青鐳,吳海山,周維江,萬年宇;兔骨髓干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化用于半月板組織工程重建[J];中國臨床康復(fù);2003年06期

4 徐青鐳,吳海山,周維江,趙定麟;膠原與骨髓干細(xì)胞重建兔半月板的組織工程研究[J];中華骨科雜志;2002年02期

5 夏萬堯,劉偉,劉天一,陳付國,崔磊,曹誼林;應(yīng)用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程化管狀軟骨的實驗研究[J];中華顯微外科雜志;2005年04期

6 劉天一,周廣東,苗春雷,魏嫻,陳付國,崔磊,劉偉,曹誼林;力學(xué)刺激影響豬骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外軟骨形成的初步研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年23期

7 湯朝暉,侯春林,張玲珍;幾丁聚糖和透明質(zhì)酸鈉對成纖維細(xì)胞增殖影響的實驗研究[J];中國矯形外科雜志;2002年11期

本文編號：2754011