【摘要】：本研究采用噬菌體表面顯示技術(shù)克隆抗CD20抗體輕、重鏈可變區(qū)基因，構(gòu)建嵌合抗CD20抗體及其Fab'片段，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)；并對(duì)Fab'抗體片段的體內(nèi)外抗瘤活性進(jìn)行研究，以期將抗CD20抗體HI47推向B淋巴細(xì)胞瘤臨床治療應(yīng)用。 一 輕重鏈可變區(qū)基因克隆及單鏈抗體庫的構(gòu)建 常規(guī)提取HI47雜交瘤細(xì)胞總RNA，利用RT-PCR法擴(kuò)增抗體輕重鏈可變區(qū)基因片段，經(jīng)Overlap PCR，利用連接鏈(G_4S)_3基因片段將抗體輕重鏈基因連接構(gòu)成單鏈抗體(ScFv)基因，將ScFv基因重組到pCANTAB 5E載體上，構(gòu)建抗CD20單鏈抗體噬菌體文庫(約3×10~6克隆)，以表達(dá)CD20分子的Daudi細(xì)胞為靶抗原，經(jīng)Panning，ELISA法篩選，獲得多個(gè)具有CD20結(jié)合活性的克隆，對(duì)克隆6的基因序列進(jìn)行序列測(cè)定分析，結(jié)果顯示克隆6的基因序列完符合PDB文庫中的抗體基本框架序列，是抗體基因序列。 二 嵌合抗體的構(gòu)建表達(dá)及活性鑒定 利用PCR從表達(dá)載體pCANTAB 5Ecd20ScFv上擴(kuò)增抗CD20抗體輕重鏈可變區(qū)基因，將VH、VL基因克隆到表達(dá)載體pYZF中，構(gòu)建抗CD20抗體表達(dá)載體pYZFcd20，并在大腸桿菌中進(jìn)行高效可溶性分泌表達(dá)Fab'，表達(dá)量可達(dá)3mg／ml。 本研究對(duì)嵌合抗CD20 Fab'片段的體內(nèi)外活性進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，競(jìng)爭(zhēng)性免疫熒光抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)ab'特異結(jié)合Daudi細(xì)胞表面CD20，MTT法測(cè)定結(jié)果表明，F(xiàn)ab'表達(dá)產(chǎn)物抑制Daudi細(xì)胞、Raji細(xì)胞的生長(zhǎng)，IC_(50)分別為69μg／ml、26μg／ml。~3H摻入試驗(yàn)顯示，嵌合抗CD20 Fab'不抑制Daudi細(xì)胞、Raji細(xì)胞DNA合成，但對(duì)RNA合成具有抑制作用。以50mg／kg劑量，四天一
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2000
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

中.勺卜和.再嗽六月州陣d七法將pCANTABSEcd20ScFv質(zhì)粒轉(zhuǎn)入TGI細(xì)菌體抗體庫，抗體庫的大小約為3x106，即1微隆。第一次pannnig前的文庫大小為10“，每次PRc、酶切鑒定，結(jié)果表明，隨著Pnaning次數(shù)均一(圖2)，經(jīng)5輪pnaning后，獲得一均一文10，。

BstNI酶切指紋圖譜

圖4.抗CD20scFv噬菌體文庫篩選和陽性克隆的鑒定。EZ、FZ、GZ、HZ為陰性對(duì)照;E3、F3、G3、H3為原始庫:E4F4、ESFS、GSHS、G6H6、G7H7、GSHS、GgHg、G1H010、GllHll、G12H12挑取6號(hào)克隆，利用APAAP法進(jìn)一步檢測(cè)其結(jié)合活性，達(dá)產(chǎn)物能和Duadi細(xì)胞特異結(jié)合(圖5)。E6F6、E7F7、ESFS、G4H4、為隨機(jī)挑取的克隆結(jié)果顯示，克隆6的表

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本文編號(hào)：2749164