【摘要】：第一部分細胞外鈣敏感受體在缺氧誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細胞胞漿鈣濃度增加中的作用和機制 目的：研究細胞外鈣敏感受體(extracellular calcium-sensing receptor, CaSR)在缺氧誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細胞胞漿內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)增加中的作用及機制。 方法：原代培養(yǎng)SD大鼠肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs);免疫組織化學(xué)染色和western blot檢測PASMCs上CaSR的表達情況；用不同濃度的細胞外Ca2+處理PASMCs檢測CaSR功能；用鈣離子熒光探針Fura-2/AM和熒光成像系統(tǒng)檢測[Ca2+]i;用H2-DCFDA和mito-RoGFP檢測細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成；shRNA基因技術(shù)干擾CaSR、STIM1和RyR3的表達,并用western blot檢測干擾效率。 結(jié)果：(1)免疫組織化學(xué)染色和western blot均檢測到PASMCs細胞膜和胞漿CaSR表達,western blot結(jié)果顯示細胞膜和胞漿中CaSR的分子量分別為55-72kD和170kD左右。(2)用4、6、7.5mM細胞外Ca2+處理PASMCs,可誘導(dǎo)ERKl/2磷酸化水平逐漸增強,同時6mM和7.5mM細胞外Ca2+又可以引起[Ca2+]i顯著增高,而此效應(yīng)可被CaSR特異性阻滯劑Calhex231所抑制。(3)缺氧可誘導(dǎo)PASMCs ROS產(chǎn)生增加,用外源性H202校正并模擬,缺氧誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生相當(dāng)于15.6μM H2O2誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。(4)缺氧以及15.6μM H2O2均能引起PASMCs [Ca24]i升高,同時Calhex231和shRNA-CaSR能抑制缺氧以及15.6μM H2O2引起的[Ca2+]i升高。(5)線粒體DNA剔除不僅抑制缺氧引起的ROS生成增多,也抑制缺氧引起的[Ca2+]i增加,這種效應(yīng)能被外源性15.6μM H2O2所逆轉(zhuǎn),Calhex231和shRNA-CaSR又能夠阻止H202對上述反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)作用。同時PEG-catalase預(yù)處理PASMCs能夠抑制缺氧引起的[Ca2+]i增加,而PEG-SOD預(yù)處理則無此作用。(5)100μM ryanodine抑制RyR功能,可以減弱缺氧和15.6μM H2O2引起的[Ca2+]i升高,但是IP3R的抑制劑20μM XeC卻無此作用；若同時應(yīng)用PKA抑制劑H-89,則100μM ryanodine不再抑制缺氧和H202引起的[Ca2+]i增加,20μM XeC卻可以抑制此反應(yīng)。儲庫操縱性鈣離子進入(store-operated Ca2+entry, SOCE)抑制劑50μM SKF96365可顯著抑制缺氧和15.6μM H2O2引起的[Ca2+]i升高。此外,STIM1和RyR3基因敲除也可減弱缺氧和H202引起的[Ca2+]i升高。結(jié)論：缺氧刺激引起PASMCs線粒體源性H202產(chǎn)生增加,增加的H202可以使CaSR敏感性增強,從而被細胞外Ca2+激活,進而引起RyR敏感性鈣通道開放,鈣庫Ca2+釋放,并激活SOCE,通過STIM1介導(dǎo)細胞外Ca2+內(nèi)流,共同造成[Ca2+]i升高。 第二部分細胞外鈣敏感受體在離體和在體缺氧性肺血管收縮中的作用 目的：探討CaSR在離體和在體缺氧性肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction, HPV)中的關(guān)鍵作用。 方法：慢病毒感染SD大鼠,下調(diào)CaSR蛋白表達；Power lab四導(dǎo)儀監(jiān)測離體肺動脈張力及大鼠在不同條件下肺動脈壓和心輸出量。 結(jié)果：(1)將慢病毒包裝的CaSR特異性干擾質(zhì)粒,從SD大鼠尾靜脈注射72小時后,western blot檢測CaSR蛋白表達水平明顯下降。(2)離體實驗中,缺氧和15.6μM H2O2均能引起肺血管張力增加,同時Calhex231能抑制缺氧以及15.6μM H2O2引起肺血管張力增加。此外,shRNA-CaSR可以抑制缺氧引起的肺血管張力增加。(3)在體實驗中,缺氧可以引起SD大鼠肺動脈壓力明顯增加,同時Calhex231和shRNA-CaSR能抑制缺氧刺激引起的肺動脈壓力增加。 結(jié)論：CaSR介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)肺動脈平滑肌細胞[Ca2+]i的升高,最終導(dǎo)致缺氧性肺血管收縮和肺動脈高壓。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363

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本文編號：2748985