【摘要】：目的 鑒于小劑量的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能,誘導(dǎo)機(jī)體的內(nèi)毒素耐受和抗腫瘤作用,本研究以臨床分離的多重耐藥性大腸埃希菌LPS制備LPS-脂質(zhì)體并考察其免疫保護(hù)作用,以探索有效預(yù)防醫(yī)院內(nèi)多重耐藥菌感染的新方法和防治腫瘤疾病的新思路。 方法 酶解法提取臨床分離的多重耐藥性大腸埃希菌TH1、TH2、TH6、TH7、 TH10LPS;鱟變形細(xì)胞溶解物試驗(yàn)(Limulus Amebocyte Lysate test,LAL)測定其體外內(nèi)毒素活性；紫外/可見光掃描測定其吸光度；凝膠色譜法純化；硫酸-苯酚法測定其糖含量。 逆向蒸發(fā)法制備LPS-脂質(zhì)體,光鏡、透射電鏡觀察其形態(tài),BI-90plus粒徑分析儀測定其粒徑分布,LAL法測定其內(nèi)毒素活性及穩(wěn)定性。 在LPS-脂質(zhì)體對活菌的免疫保護(hù)試驗(yàn)中,用LPS-脂質(zhì)體免疫小鼠,以100倍細(xì)菌LD50(50%lethal dose, LD50)活菌菌液攻擊小鼠,觀察小鼠存活情況；在LPS-脂質(zhì)體對LPS的免疫保護(hù)試驗(yàn)中,建立半乳糖胺模型使小鼠致敏,計(jì)算LPS完全致死劑量(100%lethal dose, LD100),用LPS-脂質(zhì)體免疫小鼠,以2倍LPS-LD100攻擊小鼠,觀察小鼠存活情況；在LPS-脂質(zhì)體對腫瘤的抑制試驗(yàn)中,用LPS-脂質(zhì)體免疫小鼠,經(jīng)腹腔注射S180腹水瘤細(xì)胞,觀察小鼠腹水量及生長情況,經(jīng)左側(cè)腓腸肌注射S180腹水瘤細(xì)胞,觀察小鼠實(shí)體瘤的生長情況。 結(jié)果 LPS提取物凍干后為白色絮狀物,溶于水,內(nèi)毒素活性與Sigma產(chǎn)品相當(dāng)。 LPS-脂質(zhì)體常溫下呈乳白色懸液,光鏡、透射電鏡下呈圓形或橢圓形小囊,粒徑分布均勻,為(393.542±148.402)nm。與相應(yīng)的游離LPS比較,LPS-脂質(zhì)體的內(nèi)毒素活性降低了102-103。在90天的穩(wěn)定性試驗(yàn)中,所有樣品均未發(fā)生內(nèi)毒素活性的改變；于30天取樣進(jìn)行電鏡觀察,脂質(zhì)體形態(tài)無明顯變化,粒徑分析顯示其平均值僅有輕度增加,粒徑為(432.475±155.148)nm。 在LPS-脂質(zhì)體對活菌及LPS的免疫保護(hù)試驗(yàn)中,①TH1、TH2、TH6、TH7、TH1o單一LPS-脂質(zhì)體分別免疫小鼠后,相應(yīng)的活菌和LPS攻擊小鼠,試驗(yàn)組的生存率顯著高于對照組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05),說明TH1、TH2、TH6、 TH7、TH10單一LPS-脂質(zhì)體對相應(yīng)活菌和LPS的攻擊均有一定的免疫保護(hù)作用；②TH1、TH2、TH6、TH7、TH10混合LPS-脂質(zhì)體免疫小鼠后,TH1、TH7活菌和LPS分別攻擊,試驗(yàn)組小鼠的存活率顯著高于對照組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05),銅綠假單胞菌P7、肺炎克雷伯菌K11活菌和LPS分別攻擊,試驗(yàn)組小鼠的存活率與對照組無顯著差異(P≥0.05),說明大腸埃希菌混合LPS-脂質(zhì)體對大腸埃希菌及其LPS的攻擊均有一定的免疫保護(hù)作用；③TH1、TH7、P7混合LPS-脂質(zhì)體免疫小鼠后,TH1、TH7、P7活菌和LPS分別攻擊,試驗(yàn)組小鼠的存活率顯著高于對照組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05),K11菌和LPS分別攻擊,試驗(yàn)組小鼠的存活率與對照組均無顯著差異(P≥0.05),說明TH1、P7、K11混合LPS-脂質(zhì)體對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌及其LPS的攻擊有一定免疫保護(hù)作用。 在脂質(zhì)體對腹水瘤的免疫保護(hù)性試驗(yàn)中,TH1、TH2、TH6、TH7、TH10單一LPS-脂質(zhì)體免疫組瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)及生成的腹水量均小于對照組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)；另外脂質(zhì)體免疫組小鼠體重增加大于對照組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05),說明TH1、TH2、TH6、TH7、TH10單一LPS-脂質(zhì)體對腹水瘤細(xì)胞有一定的抑制作用。 在脂質(zhì)體對實(shí)體瘤的免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)中,TH1、TH2、TH6、TH7、TH10單一LPS-脂質(zhì)體免疫組小鼠的瘤體積增長速度小于對照組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05),說明TH1、TH2、TH6、TH7、TH10單一LPS-脂質(zhì)體對實(shí)體瘤的生長有一定的抑制作用。 結(jié)論 本研究中使用的提取方法可獲得活性較高的LPS。LPS-脂質(zhì)體制備方法可行,且毒性小、穩(wěn)定性好。體內(nèi)免疫保護(hù)試驗(yàn)表明大腸埃希菌單一LPS-脂質(zhì)體對相應(yīng)活菌及其LPS的攻擊有一定免疫保護(hù)作用,對S180瘤細(xì)胞的攻擊也有一定的保護(hù)作用。大腸埃希菌混合LPS-脂質(zhì)體和TH1、P7、K11混合LPS-脂質(zhì)體均具有相對較廣泛的交叉免疫保護(hù)作用和較好的免疫效果。本研究為有效預(yù)防醫(yī)院內(nèi)多重耐藥菌感染和防治腫瘤疾病提供了新方法與新思路。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392
【圖文】：

1.2.2.2.1紫外/可見連續(xù)光譜掃描圖1在256-260nm波長附近的峰值所對應(yīng)的菌種由上向下依次為THi(0.5mg/mL)、055:B5 (0.5mg/niL)、TH!。（0. 5mg/mL)、TH7 (0.5mg/mL)、肺炎克雷伯菌 Kii (0. 5fflg/inL)o10

THl-LPS溶液在不同濃度不同波長紫外測定線圖

圖3 TH2-LPS溶液在不同濃度不同波長紫外測定線圖 表5 TH6-LPS溶液紫外測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果 濃度 0^ (mg/mL) 256nm 258腿 259nm 260nm 262nm

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2749524