【摘要】：細(xì)胞自噬(autophagy or autophagocytosis):是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因(autophagy related gene, Atg)的調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程。并能在應(yīng)激狀態(tài)下被激活,以延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。衰老(senescence)是細(xì)胞脫離細(xì)胞周期并不可逆地喪失增殖能力后進(jìn)入的一種相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài),是正常成體細(xì)胞的必然歸宿。細(xì)胞凋亡(apoptosis)是細(xì)胞應(yīng)激條件下,由基因調(diào)控的主動(dòng)且有序的自我消亡過程。應(yīng)急激活細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老的過程是癌癥發(fā)展的兩個(gè)主要障礙。 作為一種位于多種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的蛋白p53,在通過控制細(xì)胞周期,維持細(xì)胞基因組完整性及各種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中具有至關(guān)重要的作用。p53通過控制增殖細(xì)胞由細(xì)胞周期G1向S移行的控制點(diǎn)參與細(xì)胞周期調(diào)控。它強(qiáng)迫具有DNA損傷的細(xì)胞停滯在G1期并進(jìn)行DNA修復(fù)。如DNA不能被修復(fù),則誘導(dǎo)其凋亡。 p53作為衰老、自噬和凋亡的共同調(diào)控蛋白,在細(xì)胞衰老過程中,p53究竟是抑制自噬還是促進(jìn)自噬不甚清楚；同時(shí)p53可作為一種凋亡調(diào)控蛋白,對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡起重要作用,但其調(diào)控機(jī)理還不完善,尤其在與其他細(xì)胞凋亡調(diào)控因子共同存在下的作用機(jī)制還有待研究。本實(shí)驗(yàn)試圖揭示p53在細(xì)胞衰老過程中對(duì)自噬的調(diào)控作用及可能機(jī)制；以及p53對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制。為臨床治療相關(guān)疾病提供新的依據(jù)。 第一部分：p53與細(xì)胞衰老和自噬 目的：細(xì)胞衰老是細(xì)胞對(duì)多種應(yīng)激的一種反應(yīng),主要表現(xiàn)為細(xì)胞周期的停滯；自噬被認(rèn)為是細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的一種生存機(jī)制。p53是衰老和自噬共同的調(diào)控蛋白,本實(shí)驗(yàn)在觀察骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell; BMSC)衰老過程中細(xì)胞自噬改變的基礎(chǔ)上,通過干擾p53明確p53對(duì)細(xì)胞衰老和自噬的作用。 方法：取全骨髓細(xì)胞貼壁分離、培養(yǎng),獲取大鼠BMSC,流式細(xì)胞術(shù)鑒定表面標(biāo)志分子,體外誘導(dǎo)鑒定成脂肪和成骨能力；通過計(jì)算細(xì)胞倍增指數(shù)(number of cell doublings,NCD)、衰老相關(guān)SA-(?)-gal染色率等量化指標(biāo)及透射電鏡觀察細(xì)胞衰老與衰老細(xì)胞線粒體形態(tài)變化；RT-qPCR及Western blot檢測(cè)各目的基因蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1、新鮮分離的BMSC培養(yǎng)并傳至第2代(P2)時(shí),細(xì)胞呈集落樣貼壁生長(zhǎng)、顯示典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)。流式細(xì)胞儀分析顯示這些BMSC表面標(biāo)志CD54和CD90的陽性率分別為91.6%±2.42和98.86%±0.02944；而造血系統(tǒng)細(xì)胞標(biāo)志CD34和CD11的陽性率僅為0.05667%±0.03859和1.555%±0.095。這些細(xì)胞具有向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化的潛能。以上特征符合公認(rèn)的大鼠BMSC鑒定“金標(biāo)準(zhǔn)”。在P2的BMSC細(xì)胞增殖旺盛,僅存在極少數(shù)SA-β-gal染色陽性的細(xì)胞,隨著細(xì)胞的傳代培養(yǎng),BMSC的增殖逐漸減慢,SA-β-gal染色陽性的BMSC逐漸增多,在培養(yǎng)至第6代時(shí),細(xì)胞呈現(xiàn)寬大扁平狀,SA-β-gal染色陽性率達(dá)到90%。在衰老過程中,衰老相關(guān)的蛋白P53的表達(dá)逐漸增高,其下游蛋白呈相同的趨勢(shì)。 2、免疫熒光染色檢測(cè)在衰老細(xì)胞中LC3A/B增高；透射電鏡顯示線粒體的腫脹變性,出現(xiàn)大量空泡狀雙層膜樣自噬體；RT-qPCR發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)的蛋白Atg7和Atg12的mRNA在衰老過程中逐漸增高,Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)與mRNA的水平基本一致。 3、通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA可以有效的降低p53的mRNA和蛋白水平的表達(dá),作為p53下游的細(xì)胞衰老調(diào)控蛋白p21也相應(yīng)的表達(dá)下調(diào)。通過SA-β-gal染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)干擾p53的表達(dá)能夠一定程度上降低染色陽性細(xì)胞的比例。通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在干擾p53后衰老細(xì)胞的自噬相關(guān)基因的表達(dá)明顯降低。 結(jié)論： 1.大鼠BMSC進(jìn)入衰老狀態(tài)時(shí),同時(shí)也啟動(dòng)了自噬； 2.在細(xì)胞衰老過程中,p53不僅參與到細(xì)胞衰老的調(diào)控同時(shí)與細(xì)胞的自噬有關(guān)。 第二部分p53與細(xì)胞凋亡 目的：細(xì)胞凋亡或稱程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death, PCD)是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制之一,是由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡在癌癥的發(fā)生和進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用。目前尚未發(fā)現(xiàn)直接介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因,但實(shí)驗(yàn)證實(shí)P53、RASSFIA被認(rèn)為與細(xì)胞凋亡相關(guān)。p53不僅參與細(xì)胞的自噬的調(diào)控,而且p53也被確認(rèn)是細(xì)胞凋亡的一種調(diào)控蛋白,本試驗(yàn)的目的是在觀察SiHa細(xì)胞的細(xì)胞凋亡基礎(chǔ)上探討p53的細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制。 方法：構(gòu)建RASSF1A全長(zhǎng)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-RASSF1A、pcDNA-p53和RASSF1A-RNAi干涉載體分別或共同轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的SiHa細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞轉(zhuǎn)染率及細(xì)胞凋亡,RT-qPCR及Westernblot檢測(cè)各目的基因蛋白的表達(dá)。末端標(biāo)記法標(biāo)記探針WT和Mut、EMSA/Gel shift檢測(cè)p53與RASSF1A DNA的結(jié)合能力。 結(jié)果： 本研究轉(zhuǎn)染RASSF1A、p53及RASSF1A-siRNA入SiHa, Western blot分析示RASSF1A或p53單轉(zhuǎn)染能有效地提高各自的蛋白表達(dá)水平,而RASSF1A-siRNA卻抑制IASSF1A蛋白表達(dá)水平。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合膜聯(lián)蛋白V／PI染色顯示,未轉(zhuǎn)染對(duì)照組凋亡率為3.699±0.63%；pcDNA轉(zhuǎn)染對(duì)照組凋亡率為9.965±2.896%；而在單轉(zhuǎn)染RASSF1A或p53組,凋亡率分別上升至18.95±6.693%和32.932±6.173%。提示p53或RASSF1A均能誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步證實(shí)RASSF1A的效應(yīng),本研究采用siRNA進(jìn)行了阻斷實(shí)驗(yàn)。RASSF1A-siRNA轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞可顯著地阻斷內(nèi)源性RASSF1A的表達(dá)。與pcDNA轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較,RASSF1A-siRNA轉(zhuǎn)染導(dǎo)致SiHa細(xì)胞凋亡率下降至4.566±0.721%。 p53和RASSF1A超表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染可使兩者的蛋白表達(dá)水平同時(shí)提高。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合膜聯(lián)蛋白V／PI染色顯示：雖然p53或RASSF1A超表達(dá)均能加重SiHa細(xì)胞凋亡,但兩者共同超表達(dá)并無協(xié)同作用(p53和RASSF1A共轉(zhuǎn)染的促凋亡效應(yīng)與p53單獨(dú)轉(zhuǎn)染時(shí)相似)。 通過EMSA/Gel shift檢測(cè)顯示加入p53抗體到結(jié)合反應(yīng)內(nèi)可形成一個(gè)超轉(zhuǎn)移帶(抗體／p53/RASSF1A)。而單鏈探針和一個(gè)突變體RASSF1A探針減弱了p53/RASSF1A復(fù)合物的形成。同時(shí),用0-2.5μgp53檢測(cè)其抑制效果顯示明顯的劑量依賴性 結(jié)論： 1. p53、RASSF1A均參與SiHa細(xì)胞凋亡,但兩者無協(xié)同作用。 2.p53可與RASSF1A啟動(dòng)子特異性結(jié)合,p53很可能通過RASSF1A的這種牽制作用控制細(xì)胞凋亡的幅度,防止過度凋亡加重對(duì)組織的損害,使機(jī)體在應(yīng)對(duì)惡劣環(huán)境刺激時(shí),細(xì)胞的生存和死亡之間重新建立一種適宜的平衡。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2

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