【摘要】：細胞自噬(autophagy or autophagocytosis):是細胞在自噬相關基因(autophagy related gene, Atg)的調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)的過程。并能在應激狀態(tài)下被激活,以延長細胞壽命。衰老(senescence)是細胞脫離細胞周期并不可逆地喪失增殖能力后進入的一種相對穩(wěn)定的狀態(tài),是正常成體細胞的必然歸宿。細胞凋亡(apoptosis)是細胞應激條件下,由基因調(diào)控的主動且有序的自我消亡過程。應急激活細胞凋亡和細胞衰老的過程是癌癥發(fā)展的兩個主要障礙。 作為一種位于多種調(diào)控網(wǎng)絡關鍵節(jié)點的蛋白p53,在通過控制細胞周期,維持細胞基因組完整性及各種細胞應激反應中具有至關重要的作用。p53通過控制增殖細胞由細胞周期G1向S移行的控制點參與細胞周期調(diào)控。它強迫具有DNA損傷的細胞停滯在G1期并進行DNA修復。如DNA不能被修復,則誘導其凋亡。 p53作為衰老、自噬和凋亡的共同調(diào)控蛋白,在細胞衰老過程中,p53究竟是抑制自噬還是促進自噬不甚清楚；同時p53可作為一種凋亡調(diào)控蛋白,對誘導細胞凋亡起重要作用,但其調(diào)控機理還不完善,尤其在與其他細胞凋亡調(diào)控因子共同存在下的作用機制還有待研究。本實驗試圖揭示p53在細胞衰老過程中對自噬的調(diào)控作用及可能機制；以及p53對腫瘤細胞凋亡的調(diào)控機制。為臨床治療相關疾病提供新的依據(jù)。 第一部分：p53與細胞衰老和自噬 目的：細胞衰老是細胞對多種應激的一種反應,主要表現(xiàn)為細胞周期的停滯；自噬被認為是細胞在應激狀態(tài)下的一種生存機制。p53是衰老和自噬共同的調(diào)控蛋白,本實驗在觀察骨髓間充質(zhì)細胞(bone marrow mesenchymal stem cell; BMSC)衰老過程中細胞自噬改變的基礎上,通過干擾p53明確p53對細胞衰老和自噬的作用。 方法：取全骨髓細胞貼壁分離、培養(yǎng),獲取大鼠BMSC,流式細胞術鑒定表面標志分子,體外誘導鑒定成脂肪和成骨能力；通過計算細胞倍增指數(shù)(number of cell doublings,NCD)、衰老相關SA-(?)-gal染色率等量化指標及透射電鏡觀察細胞衰老與衰老細胞線粒體形態(tài)變化；RT-qPCR及Western blot檢測各目的基因蛋白的表達。 結(jié)果： 1、新鮮分離的BMSC培養(yǎng)并傳至第2代(P2)時,細胞呈集落樣貼壁生長、顯示典型的成纖維細胞形態(tài)。流式細胞儀分析顯示這些BMSC表面標志CD54和CD90的陽性率分別為91.6%±2.42和98.86%±0.02944；而造血系統(tǒng)細胞標志CD34和CD11的陽性率僅為0.05667%±0.03859和1.555%±0.095。這些細胞具有向脂肪細胞和成骨細胞分化的潛能。以上特征符合公認的大鼠BMSC鑒定“金標準”。在P2的BMSC細胞增殖旺盛,僅存在極少數(shù)SA-β-gal染色陽性的細胞,隨著細胞的傳代培養(yǎng),BMSC的增殖逐漸減慢,SA-β-gal染色陽性的BMSC逐漸增多,在培養(yǎng)至第6代時,細胞呈現(xiàn)寬大扁平狀,SA-β-gal染色陽性率達到90%。在衰老過程中,衰老相關的蛋白P53的表達逐漸增高,其下游蛋白呈相同的趨勢。 2、免疫熒光染色檢測在衰老細胞中LC3A/B增高；透射電鏡顯示線粒體的腫脹變性,出現(xiàn)大量空泡狀雙層膜樣自噬體；RT-qPCR發(fā)現(xiàn)自噬相關的蛋白Atg7和Atg12的mRNA在衰老過程中逐漸增高,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)衰老相關蛋白的表達與mRNA的水平基本一致。 3、通過慢病毒介導的shRNA可以有效的降低p53的mRNA和蛋白水平的表達,作為p53下游的細胞衰老調(diào)控蛋白p21也相應的表達下調(diào)。通過SA-β-gal染色檢測發(fā)現(xiàn)干擾p53的表達能夠一定程度上降低染色陽性細胞的比例。通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)在干擾p53后衰老細胞的自噬相關基因的表達明顯降低。 結(jié)論： 1.大鼠BMSC進入衰老狀態(tài)時,同時也啟動了自噬； 2.在細胞衰老過程中,p53不僅參與到細胞衰老的調(diào)控同時與細胞的自噬有關。 第二部分p53與細胞凋亡 目的：細胞凋亡或稱程序性細胞死亡(programmed cell death, PCD)是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機制之一,是由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡在癌癥的發(fā)生和進程中起著至關重要的作用。目前尚未發(fā)現(xiàn)直接介導細胞凋亡的基因,但實驗證實P53、RASSFIA被認為與細胞凋亡相關。p53不僅參與細胞的自噬的調(diào)控,而且p53也被確認是細胞凋亡的一種調(diào)控蛋白,本試驗的目的是在觀察SiHa細胞的細胞凋亡基礎上探討p53的細胞凋亡調(diào)控機制。 方法：構(gòu)建RASSF1A全長表達質(zhì)粒pcDNA-RASSF1A、pcDNA-p53和RASSF1A-RNAi干涉載體分別或共同轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的SiHa細胞,流式細胞術鑒定細胞轉(zhuǎn)染率及細胞凋亡,RT-qPCR及Westernblot檢測各目的基因蛋白的表達。末端標記法標記探針WT和Mut、EMSA/Gel shift檢測p53與RASSF1A DNA的結(jié)合能力。 結(jié)果： 本研究轉(zhuǎn)染RASSF1A、p53及RASSF1A-siRNA入SiHa, Western blot分析示RASSF1A或p53單轉(zhuǎn)染能有效地提高各自的蛋白表達水平,而RASSF1A-siRNA卻抑制IASSF1A蛋白表達水平。流式細胞術結(jié)合膜聯(lián)蛋白V／PI染色顯示,未轉(zhuǎn)染對照組凋亡率為3.699±0.63%；pcDNA轉(zhuǎn)染對照組凋亡率為9.965±2.896%；而在單轉(zhuǎn)染RASSF1A或p53組,凋亡率分別上升至18.95±6.693%和32.932±6.173%。提示p53或RASSF1A均能誘導SiHa細胞凋亡。為進一步證實RASSF1A的效應,本研究采用siRNA進行了阻斷實驗。RASSF1A-siRNA轉(zhuǎn)染SiHa細胞可顯著地阻斷內(nèi)源性RASSF1A的表達。與pcDNA轉(zhuǎn)染對照組比較,RASSF1A-siRNA轉(zhuǎn)染導致SiHa細胞凋亡率下降至4.566±0.721%。 p53和RASSF1A超表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染可使兩者的蛋白表達水平同時提高。流式細胞術結(jié)合膜聯(lián)蛋白V／PI染色顯示：雖然p53或RASSF1A超表達均能加重SiHa細胞凋亡,但兩者共同超表達并無協(xié)同作用(p53和RASSF1A共轉(zhuǎn)染的促凋亡效應與p53單獨轉(zhuǎn)染時相似)。 通過EMSA/Gel shift檢測顯示加入p53抗體到結(jié)合反應內(nèi)可形成一個超轉(zhuǎn)移帶(抗體／p53/RASSF1A)。而單鏈探針和一個突變體RASSF1A探針減弱了p53/RASSF1A復合物的形成。同時,用0-2.5μgp53檢測其抑制效果顯示明顯的劑量依賴性 結(jié)論： 1. p53、RASSF1A均參與SiHa細胞凋亡,但兩者無協(xié)同作用。 2.p53可與RASSF1A啟動子特異性結(jié)合,p53很可能通過RASSF1A的這種牽制作用控制細胞凋亡的幅度,防止過度凋亡加重對組織的損害,使機體在應對惡劣環(huán)境刺激時,細胞的生存和死亡之間重新建立一種適宜的平衡。
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

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本文編號：2748278