發(fā)布時間：2020-07-08 18:48

【摘要】：隨著人們生活水平的不斷提高及社會老齡化問題的日益嚴重,心腦血管血栓性疾病發(fā)病率和致死率非常高,是中老年人的常見病和多發(fā)病,嚴重威脅人類的健康。臨床上常見的急性心肌梗塞、腦血栓和彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)多數(shù)為動脈血栓,是致死或致殘的主要原因之一；血液凝固異常是這一類疾病的發(fā)生、蔓延及干預(yù)中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。 血栓性疾病在急性發(fā)病前需及早干預(yù)治療,發(fā)病后經(jīng)溶栓治療,需要長期用藥,預(yù)防血栓再次形成而復(fù)發(fā)。肝素和維生素K是臨床上常用的抗凝治療藥物,已有近百年的歷史。然而,在臨床使用過程中,不斷地發(fā)現(xiàn)肝素、維生素K等用于抗凝治療時會引發(fā)不良反應(yīng),限制了它們的使用范圍。而凝血酶作為血液凝固的關(guān)鍵因子,成為臨床上預(yù)防血栓形成的重要靶點。 水蛭素是特異性的凝血酶抑制劑,并且是一種直接凝血酶抑制劑(direct thrombin inhibitors, DTIs),臨床上用于防治血栓疾病,有著重要的應(yīng)用價值。我們實驗室研制、開發(fā)了重組雙功能水蛭素(RGD-Hirudin),中國發(fā)明專利“一種新型雙功能水蛭素及其制備方法和應(yīng)用”已授權(quán),專利號：ZL01105798.X。RGD-Hirudin是在野生型水蛭素分子的合理部位融合了Arg-Gly-Asp (RGD)三肽,使這種水蛭素衍生物既保留了抗凝血酶活性,又增加了抑制血小板聚集的活性,具有降低血黏度,抗栓、防栓等作用。經(jīng)過藥效學(xué)研究證明用于血管吻合術(shù)后抗凝治療,療效優(yōu)于野生型水蛭素和肝素。但是RGD-Hirudin是一種蛋白質(zhì)/多肽類藥物,只能通過靜脈注射的給藥方式用藥,臨床應(yīng)用范圍有限。 目前,已有四種注射用DTIs及一種口服DTI成功用于臨床。然而,這些藥物的臨床適應(yīng)癥狀單一,每種DTI都針對特定的病癥,且治療費用昂貴。所以,開發(fā)新型DTIs(包括注射和口服給藥方式)無論在治療和預(yù)防血栓栓塞疾病方面還是在經(jīng)濟效益方面都具有極為廣闊的前景。 本項研究的主要目的是從重組雙功能水蛭素的結(jié)構(gòu)和功能研究入手,發(fā)現(xiàn)其與凝血酶相互作用的重要位點,闡明兩者相互作用機制,對雙功能水蛭素作進一步的改造,設(shè)計和研制具有抗凝活性的小分子多肽,用于開發(fā)口服或皮下注射的抗凝防栓藥物。 本論文研究內(nèi)容主要包括四個部分： 1.利用畢赤酵母表達系統(tǒng),通過高密度發(fā)酵的方法,采用適當(dāng)純化方案,以13C甘油、13C甲醇分別為生長階段和誘導(dǎo)階段提供碳源；以15N硫酸銨為氮源,對RGD-hirudin作15N/13C均一標(biāo)記,經(jīng)發(fā)酵和純化,獲得15N/13C全標(biāo)記RGD-hirudin,對其純度、分子量及生物學(xué)活性進行了鑒定,為深入開展構(gòu)效關(guān)系研究打下了良好的基礎(chǔ)。 2.利用多維核磁共振技術(shù),對15N/13C均-標(biāo)記的RGD-hirudin作了1D’H譜,3D CBCA(CO)NH譜,3D CBCANH譜,3D HNCO譜,2D1H-15N HSQC譜的測定,并對骨架共振信號進行了歸屬指認。利用化學(xué)位移擾動實驗研究了15N/13C均勻標(biāo)記的RGD-hirudin與凝血酶的相互作用位點,明確了RGD-hirudin的關(guān)鍵氨基酸殘基位點。 3.利用同源建模的方法模擬了RGD-hirudin的全長結(jié)構(gòu),通過分子對接的方法得到RGD-hirudin與凝血酶復(fù)合物的模型結(jié)構(gòu),結(jié)合NMR化學(xué)位移擾動實驗的結(jié)果,對RGD-hirudin與凝血酶的相互作用進行了深入的分析。為了驗證復(fù)合體模型的準確性,進一步對兩者相互作用過程中,與凝血酶形成氫鍵的RGD-hirudin氨基酸殘基進行了虛擬丙氨酸掃描,分析突變體穩(wěn)定性及合理性。利用重組DNA技術(shù),將計算機模擬得到的關(guān)鍵氨基酸殘基作丙氨酸單點突變,獲得了6個RGD-hirudin的突變體。測定了這些突變體的抗凝活性和抗血小板聚集的活性；利用表面等離子共振實驗(SPR)分別測定了RGD-hirudin和這些突變體與凝血酶相互作用的親和力。確認RGD-hirudin與凝血酶相互作用關(guān)系,即RGD-hirudin的C-末端與凝血酶exosites I結(jié)合,N-末端與凝血酶活性位點結(jié)合,抑制凝血酶活性。 4基于RGD-hirudin的結(jié)構(gòu)功能研究結(jié)果,以RGD-hirudin的序列為基礎(chǔ),保留其與凝血酶結(jié)合的功能氨基酸殘基,借助分子模擬軟件(Discovery Studio3.0)設(shè)計了兩條具有抗凝活性的小分子短肽。以畢赤酵母為宿主菌表達上述短肽肽,純化后測定抗凝血酶活性,HPLC測定純度,MS測定分子量,結(jié)果顯示兩條短肽具有抗凝活性,分子量分別為3925.5247Da(35肽)和4024.5459Da(36肽)。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3411

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 莫煒,張艷玲,王龍生,楊新英,宋后燕;重組雙功能水蛭素的發(fā)酵、純化和鑒定[J];生物工程學(xué)報;2004年01期

本文編號：2746911