【摘要】：背景與目的： 以問號鉤端螺旋體為代表的致病性鉤端螺旋體廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，引起的人獸共患病稱為鉤端螺旋體病，簡稱鉤體病。該病是我國重點(diǎn)防控的傳染病之一，目前常用診斷鉤體病的方法和應(yīng)用的疫苗存在各自的缺點(diǎn)。近年的研究表明，外膜蛋白是鉤體外膜中的重要組成部分，其中多種組分具有致病性和免疫原性。本研究為提高血清學(xué)檢測的敏感性和特異性，克隆、表達(dá)LipL21, Loa22,LipL32和LigACon4-8，并以這4種重組蛋白為抗原，建立檢測馬和狗血清中相應(yīng)抗體的ELISA和狗血清中相應(yīng)抗體的LUMINEX法，為研制診斷鉤體病的新血清學(xué)檢測方法奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。應(yīng)用分子生物學(xué)方法，構(gòu)建CTB-OmpL1重組乳酸菌口服疫苗，并利用倉鼠模型評價其免疫保護(hù)作用，為研制新型疫苗奠定基礎(chǔ)。 研究內(nèi)容與方法： 1.采用PCR方法，從鉤端螺旋體基因組DNA中分別擴(kuò)增LipL21,Loa22, LipL32和LigACon4-8基因片段，構(gòu)建原核表達(dá)載體LipL21-PET28/Rosetta, Loa22-PET28/Rosetta, LipL32-PGEX4T2/BL21， LigACon4-8 PET28/Rosetta，大量誘導(dǎo)表達(dá)重組菌，運(yùn)用Ni+NTA及正負(fù)離子吸咐柱純化獲得重組蛋白,用Wester blot鑒定。 2.以重組蛋白LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8為抗原，建立檢測馬血清和狗血清中相應(yīng)抗體的ELISA，用建立的ELISA檢測大量臨床馬血清和狗血清并與傳統(tǒng)MAT比較，評價其診斷價值。 3.以重組蛋白LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8為抗原，建立檢測狗血清中相應(yīng)抗體的Luminex法,檢測大量臨床狗血清中相應(yīng)抗體,并與傳統(tǒng)MAT比較，評價其診斷價值。 4.用基因工程技術(shù)，克隆、表達(dá)鉤端螺旋體重組蛋白CTB-OmpL1，轉(zhuǎn)入乳酸菌中制備CTB-OmpL1口服疫苗；制備倉鼠鉤體感染動物模型，通過該模型評價該口服疫苗的免疫保護(hù)作用。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒LipL21-PET28/Rosetta, Loa22-PET28/Rosetta, LipL32-PGEX4T2/BL21， LigACon4-8-PET28/Rosetta，雙酶切鑒定基因完整，基因測序結(jié)果表明與Genebank基因序列基本一致，表達(dá)重組菌后獲得2-5mg/ml濃度，純度達(dá)90%以上的高濃度的純化蛋白。Wester blot結(jié)果顯示重組蛋白能與感染鉤體的馬和狗血清發(fā)生反應(yīng)。 2.用LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8重組蛋白為抗原建立的ELISA檢測130例MAT陰性和176例MAT陽性馬血清,對馬血清檢測結(jié)果，其敏感性分別可達(dá)84.66%，77.84%，77.84%，82.39%，特異性達(dá)83.85%，92.31%，86.15%，86.15%。 3.用LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8重組蛋白為抗原與203例MAT陽性，102例MAT陰性狗血清作ELISA檢測，其敏感性分別可達(dá)99.5%，89.7%，92.6%，97.5%，特異性達(dá)84.3%，81.4%，84.3%，84.3%。 4.用LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8重組蛋白為抗原建立了檢測狗血清中相應(yīng)抗體的Luminex法，檢測了203例MAT陽性，20例MAT陰性狗血清，其敏感性分別可達(dá)89.66%，75.86%，82.27%，78.33%，特異性達(dá)85.0%，80.0%，90.0%，80.0%。 5.構(gòu)建了重組CTB-OmpL1乳酸菌口服疫苗，建立了鉤體感染的倉鼠動物模型；口服疫苗免疫倉鼠后可產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)較果，攻毒后免疫倉鼠存活率可達(dá)87.5%。 結(jié)論： 成功表達(dá)LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8，獲得高純度的重組蛋白，均具有良好的抗原性。成功建立了檢測馬和狗血清中鉤體抗體的ELISA，成功建立了檢測狗血清中鉤體抗體的Luminex法，經(jīng)檢測大量馬與狗的臨床血清標(biāo)本，具有較高的敏感性和特異性。鉤體重組CTB-OmpL1乳酸菌口服疫苗在倉鼠模型中表現(xiàn)出較好的免疫保護(hù)效果。為研制診斷鉤體病的新血清學(xué)檢測方法奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。成功構(gòu)建了CTB-OmpL1重組乳酸菌口服疫苗，經(jīng)倉鼠模型評價具有較好的免疫保護(hù)作用，為研制新型疫苗奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【圖文】：

圖 1.1 目的基因 PCR 擴(kuò)增圖Fig.1.1 PCR products for target geneM: DNA marker; 1: LipL21; 2: Loa22; 3: LipL32 4: LigACon4-8質(zhì)粒的測序L21-PET28/Rosetta, Loa22-PET28/Rosetta, LipL32-PGE PET28/ Rosetta，進(jìn)行測序分析，所得序列與 Geneba Loa22, LipL32 和 LigACon4-8 比對后可見一致率分別達(dá)結(jié)果見圖 1.2-圖 1.5。

圖 1.2 LipL21 在 LipL21-PET28/Rosetta 中測序結(jié)果Fig.1.2 LipL21DNA sequence in LipL21-PET28/Rosetta

29圖 1.3 Loa22 在 Loa22-PET28/Rosetta 中測序結(jié)果Fig.1.3 Loa22DNA sequence in Loa22-PET28/Rosetta

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 張連英;丁朋曉;楊正久;譚立志;;鉤端螺旋體外膜蛋白的研究概況[J];中國醫(yī)藥科學(xué);2013年09期

2 ;A Sensitive and Specific IgM-ELISA for the Serological Diagnosis of Human Leptospirosis Using a rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2 Fusion Protein[J];Biomedical and Environmental Sciences;2011年03期

3 姜久昆;嚴(yán)杰;;鉤端螺旋體主要外膜蛋白在診斷和疫苗研制方面的進(jìn)展[J];中國人獸共患病學(xué)報;2008年06期

本文編號：2745263