發(fā)布時間：2020-07-07 08:19

【摘要】：真核生物基因表達調控涉及順式作用元件與反式作用因子、反式作用因子與反式作用因子之間極其復雜的相互作用。核受體超家族屬于反式作用因子，是一類配體依賴性轉錄因子，其成員廣泛介導了真核生物與生長、發(fā)育和內環(huán)境穩(wěn)定相關基因的表達。目前，核受體調節(jié)基因表達的機制正處于廣泛的研究中。許多研究表明，核受體在調節(jié)靶基因表達時會與一系列有效轉錄所必需的輔調節(jié)蛋白(coregulator)發(fā)生相互作用，這類輔調節(jié)蛋白主要包括輔活化子(coactivator)和輔阻遏子(corepressor)，核受體通過輔活化子／輔阻遏子與基礎轉錄機器聯(lián)系在一起，調節(jié)不同靶基因的啟動子、配體或細胞類型特異性的表達。迄今已分離鑒定出大量的核受體輔活化子，如RIP140、CBP／P300、SRC／p160家族、CARM-1、TRAP／DRIP等，包括最近發(fā)現(xiàn)的SRA(一種有輔活化子功能的RNA)。大多數(shù)輔活化子結構上均含有與核受體有效相互作用所必須的重復LXXLL模體(NR盒)，它們對核受體轉錄功能的調節(jié)是一個復雜的多步過程，還涉及了核受體結合DNA時對核受體的酶學修飾。 人雌激素受體相關受體1(human estrogen receptor-related receptorl，hERR1)是核受體超家族中的成員，是最早被克隆的孤兒受體之一，與雌激素受體(estrogen receptor，ER)有很高的同源性，廣泛表達于體內各種組織，在骨骼發(fā)育與形成、脂肪代謝中有重要作用。hERR1的效應元件(hERR1 response element,ERRE)與ERE(ER response element)和SFRE(steroidogenic factor 1 response element)有很高同源性，因而hERR1與ER和SF1的靶基因也有很多交叉和重疊。許多研究發(fā)現(xiàn)，hERR1可通過與ER競爭結合DNA，或與ER直接相互作用，影響ER的轉錄調控功能。hERR1在調節(jié)基因表達過程中，還涉及hERR1與TFⅡB及許多輔活化子如ACTR、GRIP1、SRC-1、PNRC等的相互作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，hERR1表達于正常及癌變的乳腺組織，并且在癌組織中的表達量明顯高于正常乳腺組織，提示hERR1與乳腺癌密切相關。本研究是在上述工作基礎上的深入，主要的研究目標和結果如下： 1．采用酵母雙雜交技術篩選了人乳腺組織cDNA表達文庫中的hERR1的相互作用蛋白質并對結果進行了序列分析和鑒定。 為深入了解hERR1在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中可能的作用機理，我們采用酵母雙雜交 第三軍醫(yī)大學博士學位論文 結合濾膜影印分析，篩選了人乳腺組織cDNA表達文庫，以尋找乳腺組織中能與hERRI 發(fā)生相互作用的蛋白質;采用酵母雙雜交分析結合液相p一半乳糖昔酶活性測定，進一 步明確了這種相互作用，并通過測序和序列比對分析，確定了所獲得的蛋白質的種類。 結果發(fā)現(xiàn):1) hERRI可與多種核受體輔活化子(SRC一1、班P14O、們燈P一l)發(fā)生相互 作用;2)首次篩選到多個能與hERRI相互作用的蛋白質，其中包括RBP4( retinol binding pfotein)。 2.檢測了RBP4與多種核受體間的相互作用及其對核受體AF一(activation function 2)結構域的依賴性。 為進一步明確RBP4與hERRI之間的相互作用，并深入探討這種相互作用的普遍 性，我們采用酵母雙雜交技術檢測了RBP4與hERRI及其它多種核受體間的相互作用， 并分析了這種相互作用對核受體特異性配體及AF一2結構域的依賴性。結果發(fā)現(xiàn):1) 在酵母細胞中，RBP4能以配體依賴性或非依賴性方式，與包括hERRI和hER在內的 多種核受體發(fā)生相互作用:2) RBP4與核受體hER和孤兒核受體mERR3的相互作用， 有賴于核受體AF一2結構域的完整性。以上實驗結果提示，RBP4可能是一個新的功能 有待鑒定的核受體轉錄激活功能的調節(jié)因子。 3.研究了RBP4對hER和hERRI轉錄激活功能的調節(jié)作用。 為了解RBP4的轉錄調節(jié)功能，我們采用瞬時轉染結合熒光素酶活性分析的方法， 研究了RBP4對hER和hERRI轉錄激活功能的影響。結果發(fā)現(xiàn):l)在HeLa細胞中， RBP4能以濃度依賴和配體非依賴方式，顯著增強hERRI的轉錄激活功能;2)在HeLa 細胞中，RBP4能與hER相互作用，且在一定濃度范圍內以濃度依賴和配體依賴方式， 顯著增強hER的轉錄激活功能。 4.對RBP4與hERRI相互作用的位點進行了初步鑒定。 綜合酵母雙雜交及瞬時轉染的實驗結果，我們初步認為，RBP4是一個核受體輔活 化子。為探討RBP4與hERRI相互作用的分子機理及其在hERRI基因表達調控中的作 用，我們采用缺失突變和酵母雙雜交分析等方法，初步探討了RBP4與hERRI的相互 作用位點。結果發(fā)現(xiàn):1) RBP4的aa19一108是其與hERR.1發(fā)生相互作用的主要部位; 2)RBP4的aa1Og一199不是RBP4與hERRI相互作用的主要部位，但位于該部分的一 些氨基酸殘基可能參與了這二者之間的相互作用;3) RBP4的aa133一199未見能與 hERRI發(fā)生相互作用，而位于RBP4N一末端的信號膚序列(aal一18)，可能干擾RBP4 與hERRI的相互作用。 以上研究結果表明:1) hERRI轉錄調節(jié)功能的發(fā)揮，有賴于多種蛋白因子包括核 受體輔活化子及其它一些功能有待進一步明確的蛋白質的參與;2) RBP4是被篩選到 的hERRI相互作用蛋白之一，可能參與了對hERRI轉錄激活功能的調節(jié)過程;3)RBP4 第三軍醫(yī)大學博士學位論文 能以配體依賴性、AF一2依賴性方式，與被檢測的絕大多數(shù)核受體?
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346
【圖文】：

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【參考文獻】

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本文編號：2744885