本文關(guān)鍵詞：基于RNA-seq技術(shù)對鼠疫耶爾森氏菌小RNA的篩選與鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：鼠疫是鼠疫耶爾森菌引起的自然疫源性傳染病。鼠疫可通過蚤叮咬或者其它途傳染給人,引發(fā)腺鼠疫、肺鼠疫和敗血癥鼠疫。調(diào)節(jié)小RNAs (small regulatory RNAs, sRNAs)是一類長度在50-500個(gè)核苷酸,位于基因間區(qū)或反義鏈上,不編碼蛋白質(zhì)的RNAs。sRNAs通過與靶mRNA配對,模擬其他核酸結(jié)構(gòu)或調(diào)節(jié)蛋白活性在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用,其調(diào)控作用大多需要伴侶蛋白Hfq (host factor for RNA phage Qβ)的參與。近年來研究發(fā)現(xiàn)sRNAs在細(xì)菌代謝、毒力和宿主環(huán)境適應(yīng)性等多個(gè)方面發(fā)揮著重要作用。RNA-seq (RNA sequencing)是基于高通量測序技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄組的新方法,可以同時(shí)用于研究致病菌和宿主轉(zhuǎn)錄組,也可以預(yù)測基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并發(fā)現(xiàn)新的sRNAs。 本研究提取體外(BHI和TMH培養(yǎng)基內(nèi)26℃培養(yǎng)基至對數(shù)中期)和體內(nèi)(滴鼻感染48hr小鼠肺臟和脾臟)條件下的鼠疫菌總RNA,變性膠分離并分別回收50-150nt和130-500nt RNA,磷酸化后分別加接頭,逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA文庫進(jìn)行高通量深度測序(RNA-seq),去接頭、去污染和剔除rRNA和tRNA后,對獲得的序列進(jìn)行基因組定位,篩選獲得位于基因間區(qū)和反義鏈的轉(zhuǎn)錄本。 挑選存在于兩個(gè)樣品以上的轉(zhuǎn)錄本,最終篩選獲得104個(gè)鼠疫菌sRNAs。其中,78個(gè)是鼠疫菌中新發(fā)現(xiàn)的,26個(gè)是已經(jīng)注釋的。新發(fā)現(xiàn)的78個(gè)鼠疫菌sRNAs中,有62個(gè)位于基因間區(qū),16個(gè)位于基因的反義鏈上。共有5個(gè)新的鼠疫菌小RNA位于pMT1和pPCPl質(zhì)粒上。 我們采用引物延伸實(shí)驗(yàn)確定了鼠疫菌sRNAs sR034、sR035和sR084的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),與RNA-seq結(jié)果一致,并采用Northern Blot方法驗(yàn)證了14個(gè)新sRNAs的存在,且大小與測序結(jié)果基本一致,驗(yàn)證了RNA-seq用來同時(shí)篩選不同樣品中的sRNAs的準(zhǔn)確性和可靠性。除此以外,我們還通過Northern blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了9個(gè)新的sRNAs穩(wěn)定性依賴于RNA伴侶分子Hfq蛋白,并確定了CRP調(diào)控元的3個(gè)sRNAs新成員—sR065、sR066和sR084。
【關(guān)鍵詞】：鼠疫菌 sRNAs RNA-seq Hfq
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378.61
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-6
• 縮略語6-9
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述及選題的目的和意義9-20
• 1. 鼠疫的流行與危害9-12
• 1.1 鼠疫菌的傳播途徑10
• 1.2 鼠疫菌的病原學(xué)特征10-12
• 2. 細(xì)菌基因表達(dá)調(diào)控12-14
• 2.1 細(xì)菌基因表達(dá)調(diào)控類型及特點(diǎn)12-13
• 2.2 細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子13-14
• 3. sRNAs的調(diào)控與功能研究進(jìn)展14-16
• 3.1 sRNAs概述14
• 3.2 sRNAs的作用機(jī)制14-15
• 3.3 sRNAs調(diào)控細(xì)菌生理與毒力15-16
• 4. Hfq蛋白密切參與sRNAs調(diào)控16-17
• 5. sRNAs的大規(guī)模篩選與鑒定技術(shù)17-18
• 6. 選題的目的和意義18-20
• 第二部分 材料和方法20-42
• 1. 材料20-30
• 1.1 菌株20
• 1.2 培養(yǎng)基20-24
• 1.4 主要儀器和設(shè)備24-25
• 1.5 其他試劑及配制方法25-28
• 1.6 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物28-29
• 1.7 實(shí)驗(yàn)所用引物匯總29-30
• 2. 方法30-42
• 2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)與體內(nèi)感染BALB/c小鼠30
• 2.2 體內(nèi)感染BALB/c小鼠30-31
• 2.3 Trizol提取總RNA和sRNAs片段富集31-33
• 2.4 cDNA文庫的制備、測序與數(shù)據(jù)分析33-34
• 2.5 引物延伸實(shí)驗(yàn)確定sRNAs的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)34-36
• 2.6 Northern Blotting驗(yàn)證sRNAs的存在與大小36-42
• 第三部分 結(jié)果及討論42-57
• 1. 結(jié)果42-53
• 1.1 基于RNA-seq技術(shù)篩選到104個(gè)sRNAs42-45
• 1.2 部分sRNAs轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定45-48
• 1.3 部分sRNAs存在與大小的驗(yàn)證48-49
• 1.4 sR034與sR035表達(dá)豐度驗(yàn)證49-50
• 1.5 部分sRNAs穩(wěn)定性的Hfq依賴性驗(yàn)證50-51
• 1.6 CRP調(diào)控sRNAs的預(yù)測與驗(yàn)證51-53
• 2. 討論53-57
• 2.1 RNA-seq用于致病菌和宿主轉(zhuǎn)錄組的研究53-54
• 2.2 sRNAs與鼠疫菌進(jìn)化54
• 2.3 Hfq對鼠疫菌sRNAs的作用54-55
• 2.4 sRNAs與鼠疫菌生理和毒力55-57
• 第四部分 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-62
• 致謝62-64
• 攻讀碩士期間主要成果64

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 孟霞;孟憲臣;朱春紅;王亨;王金秋;聶佳佳;朱國強(qiáng);;腸炎沙門氏菌hfq缺失株的構(gòu)建和對fliC基因的調(diào)控分析[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2013年09期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李自慧;結(jié)核分枝桿菌非編碼RNA的系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)和鑒定[D];北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所;2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 陳秀琴;Hfq對霍亂弧菌環(huán)境適應(yīng)能力的影響及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[D];青島大學(xué);2013年

2 劉鐘慧;恥垢分枝桿菌體外非編碼RNA的鑒定與初步分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 朱穎;RNA適體與代謝小分子相互作用的研究[D];中國海洋大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：基于RNA-seq技術(shù)對鼠疫耶爾森氏菌小RNA的篩選與鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：274517