本文關(guān)鍵詞：樹突狀細(xì)胞來源外排體對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，其主要的靶細(xì)胞為樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）。然而，對于DC對MSC的生物學(xué)特性的影響及其介質(zhì)，目前未見系統(tǒng)報(bào)告。本實(shí)驗(yàn)以DC釋放的外排體（DC-derived exosome，DCex）為觀察對象，探討了DC對MSC的可能作用。首先，分離培養(yǎng)人骨髓MSC，并從細(xì)胞形態(tài)、表型及分化功能予以鑒定。體外誘導(dǎo)培養(yǎng)人骨髓來源的DC，通過觀察細(xì)胞形態(tài)、流式檢測表型給予鑒定。應(yīng)用超速離心法從DC條件培養(yǎng)上清中分離提取DCex，電鏡觀察DCex形態(tài)特點(diǎn)，通過流式檢測明確其細(xì)胞來源，BCA蛋白定量法測定DCex蛋白濃度，從而建立一套可靠的制備及鑒定DCex實(shí)驗(yàn)體系。其次，以DAPI標(biāo)記的MSC為研究對象，將DiI標(biāo)記的DCex與MSC共培養(yǎng)，應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察MSC內(nèi)吞DCex的可能性。最后，在無血清MSC培養(yǎng)體系中，分別加入不同蛋白質(zhì)濃度DCex（0、1、2、5、10、15μg·ml-1），以0μg·ml-1組為對照，應(yīng)用MTT法于24、48、72h后檢測MSC增殖狀態(tài)，并且利用CFSE標(biāo)記及流式細(xì)胞學(xué)分析，進(jìn)一步驗(yàn)證DCex對MSC的增殖作用。另取第3代MSC，設(shè)為3組培養(yǎng)誘導(dǎo)體系：①對照組：α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基組；②實(shí)驗(yàn)組：α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+DCex（10ug·mL-1）組；③α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)劑組。采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR、瓊脂糖凝膠電泳檢測各組成骨分化轉(zhuǎn)錄因子Runx2在mRNA水平的表達(dá)情況,并進(jìn)行堿性磷酸酶（ALP）活性檢測。結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的MSC，鏡下為成纖維狀貼壁細(xì)胞，可向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞分化，表達(dá)CD44和CD73，不表達(dá)CD31、CD45和HLA-DR，符合國際干細(xì)胞協(xié)會關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出DC，可見DC表面典型的毛刺狀突起，并表達(dá)CD80、CD86、CD83、HLA-DR。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，DCex呈圓形或橢圓形膜層結(jié)構(gòu)，直徑為40-100nm，符合外排體的基本形態(tài)特征。流式細(xì)胞學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，DCex表達(dá)CD83、CD86、CD80和HLA-DR，證實(shí)了DCex的細(xì)胞來源。熒光標(biāo)記的DCex與MSC共培養(yǎng)6h時(shí)，可在共聚焦顯微鏡下觀察到MSC胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)熒光，隨著作用時(shí)間延長，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。MTT實(shí)驗(yàn)顯示，以0μg·mL-1DCex組作為對照（增殖率100%），實(shí)驗(yàn)組MSC增殖率分別為：（102.4±7.99）%、（114.6±5.82）%、（135.5±11.9）%、（198.3±17.6）%、（198.2±32.2）%、DCex濃度為1、2μg·mL-1的增殖效應(yīng)不明顯（P0.05）,而濃度為5、10、15μg·mL-1的實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，差異顯著（P0.05）。其中，當(dāng)DCex濃度為10、15μg·mL-1時(shí)對MSCs的促增殖作用更明顯（P0.001）。與對照組相比，DCex（5、10、15μg·mL-1）組細(xì)胞均在48h出現(xiàn)促增殖作用（P0.001）。CFSE標(biāo)記及流式檢測也證實(shí)DCex可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖。此外，按組培養(yǎng)第7天，DCex實(shí)驗(yàn)組Runx2表達(dá)較對照組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；MSC培養(yǎng)第14天，DCex組ALP含量OD值與對應(yīng)蛋白比為2.22±0.27，顯著高于陰性對照組（1.20±0.21）（P0.01），但低于標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)組（3.22±0.24）（P0.05）。 上述結(jié)果表明，，DCex可被MSC內(nèi)吞由此引起MSC增殖速度加快，并使之向成骨細(xì)胞方向分化。因此推測，DCex可能是DC作用于MSC的一種新介質(zhì)。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞 外排體 增殖 成骨分化
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 英文縮寫8-10
• 前言10
• 材料與方法10-23
• 結(jié)果23-27
• 附圖27-34
• 附表34-35
• 討論35-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-42
• 綜述 樹突狀來源外排體：一種免疫調(diào)節(jié)的新角色42-49
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 致謝49-50
• 個(gè)人簡歷50

【參考文獻(xiàn)】

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1 顏汝平;周海濱;李

本文編號：274266