本文關(guān)鍵詞：大腸埃希菌ampC基因LAMP檢測(cè)方法的建立及其初步應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一、研究目的和背景 近年來(lái),細(xì)菌耐藥性已成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危機(jī),它可導(dǎo)致患者治療的失敗、醫(yī)療費(fèi)用的增加和病死率的上升,更為嚴(yán)重的是,細(xì)菌耐藥性的進(jìn)一步發(fā)展,可能使人類重新面臨感染性疾病無(wú)藥可治的威脅。世界衛(wèi)生組織(WHO)最近警告說(shuō),如果人類不能盡快采取有效行動(dòng),細(xì)菌耐藥性危機(jī)將全面來(lái)臨。目前,幾乎所有的抗生素都有相應(yīng)的細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性,其中,p-內(nèi)酰胺酶引起的細(xì)菌耐藥最令人擔(dān)憂。p-內(nèi)酰胺酶已經(jīng)從初始的普通酶演變成為廣譜酶、超廣譜酶(ESBLs)、碳青霉烯酶等,臨床亦發(fā)現(xiàn)對(duì)所有p-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等。 AmpC酶是一類主要由腸桿菌科細(xì)菌、枸櫞酸桿菌、銅綠假單胞菌等產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶,它能水解青霉素和第一代、第二代、第三代頭孢菌素,以及單環(huán)類β-內(nèi)酰胺類抗生素,且大多引發(fā)多重耐藥。近年來(lái),隨著頭孢菌素類及p-內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛使用,AmpC酶的臨床檢出率不斷攀升,已成為革蘭陰性桿菌產(chǎn)生耐藥性的主要原因。 AmpC酶的合成與ampC、ampR、ampD、ampE、ampG五種基因有關(guān)。其中ampC基因是AmpC酶的結(jié)構(gòu)基因,大多存在于細(xì)菌的染色體上,部分也可存在于質(zhì)粒上,能編碼由380個(gè)氨基酸組成的、分子量為39.6KDa的AmpC酶。與染色體介導(dǎo)的AmpC酶不同,質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶大多為持續(xù)高產(chǎn)型AmpC酶,其產(chǎn)生亦無(wú)需抗生素的誘導(dǎo),并且耐藥基因可迅速傳播到不同的菌屬和菌種,為耐藥危機(jī)的暴發(fā)埋下隱患。 目前,AmpC酶的檢測(cè)方法主要有兩類：一是粗提耐藥細(xì)菌的AmpC酶做藥敏試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè),主要有頭孢西丁(FOX)敏感試驗(yàn)、AmpC酶表型篩選試驗(yàn)、氟氯西林(FCC)雙紙片擴(kuò)散協(xié)同實(shí)驗(yàn)、三維試驗(yàn)等；二是對(duì)編碼AmpC酶的基因進(jìn)行檢測(cè)。直接針對(duì)AmpC酶進(jìn)行檢查的試驗(yàn)可靠性較高,但一般需要提取酶的粗提物,操作繁瑣、比較費(fèi)時(shí),難以在大多數(shù)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用。AmpC酶的基因檢測(cè)是利用分子生物學(xué)方法測(cè)定待檢細(xì)菌中AmpC酶的基因序列,其結(jié)果準(zhǔn)確,但需嚴(yán)格防止因污染造成的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是日本學(xué)者Notomi等建立的一種新的核酸檢測(cè)技術(shù)。其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6或8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4或6條特異性引物,利用鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件(65℃左右)下保溫幾十分鐘,即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn),與常規(guī)PCR相比,不需模板的熱變性、溫度循環(huán)等過(guò)程,也不依賴任何專門的儀器設(shè)備,可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于PCR術(shù),檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR,適于大規(guī)模樣品的檢測(cè)和基層單位推廣應(yīng)用,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、病原微生物檢測(cè)以及動(dòng)物胚胎的性別鑒定等諸多領(lǐng)域。 LAMP的反應(yīng)體系主要包括DNA模板、引物(包括內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物)、甜菜堿、dNTPs、Mg2+、Bst DNA聚合酶、Bst buffer等。為了實(shí)現(xiàn)LAMP對(duì)目的基因的準(zhǔn)確檢測(cè),須對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,探索體系中各種成份的最佳濃度,并對(duì)靈敏度和特異性進(jìn)行評(píng)估。由于LAMP具有很高的靈敏度,故應(yīng)采取適當(dāng)?shù)拇胧┓乐刮廴?以防產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。 大腸埃希菌是目前引起醫(yī)院感染的首位致病菌,從我國(guó)醫(yī)院對(duì)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果來(lái)看,大腸埃希菌的耐藥檢出率在逐年升高。特別是近十多年來(lái),隨著廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素,尤其是第三代頭孢菌素的廣泛使用,產(chǎn)AmpC酶的大腸埃希菌日益多見。AmpC酶的產(chǎn)生使大腸埃希菌對(duì)大量抗生素產(chǎn)生耐藥性,通常包括青霉素和除頭孢匹羅和頭孢吡肟以外幾乎全部的頭孢菌素類藥物。另外,產(chǎn)AmpC酶的大腸埃希菌也可能伴有ESBLs的產(chǎn)生,從而產(chǎn)生耐廣譜頭孢菌素的現(xiàn)象。同時(shí)產(chǎn)ESBLs和AmpC酶的大腸埃希菌通常還會(huì)攜帶其他的耐藥基因,這將導(dǎo)致臨床治療更加困難,甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的耐藥性危機(jī)。 建立適合臨床應(yīng)用的產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌篩選體系和了解產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌的流行情況是制定有效防治對(duì)策的前提。本研究旨在建立檢測(cè)大腸埃希菌ampC基因的LAMP方法,驗(yàn)證將其運(yùn)用于檢測(cè)產(chǎn)AmpC酶大腸埃希菌的有效性,并初步探索檢測(cè)ampC基因的應(yīng)用價(jià)值。 二、研究方法 1.大腸埃希菌ampC基因LAMP檢測(cè)方法的建立 (1)根據(jù)GenBank公布的ampC基因序列(No:NC_008490.1),采用LAMP引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer4.0進(jìn)行設(shè)計(jì),得到一套特異性LAMP引物,包括兩條外引物F3、B3,兩條內(nèi)引物FIP、BIP和兩條環(huán)引物L(fēng)B、LF。建立25μl的LAMP反應(yīng)體系。 (2)采用瓊脂糖凝膠電泳的方法,對(duì)LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,確定反應(yīng)體系中dNTPs、betaine(甜菜堿)、Mg2+的濃度,以及最佳的反應(yīng)時(shí)間。 (3)驗(yàn)證建立的LAMP方法的特異性和靈敏度,并與PCR法進(jìn)行比較,探討LAMP法的優(yōu)勢(shì)。 2. LAMP法檢測(cè)大腸埃希菌ampC基因的初步應(yīng)用 (1)用建立的LAMP方法檢測(cè)54株大腸埃希菌臨床分離株,并提取細(xì)菌質(zhì)粒,計(jì)算質(zhì)粒介導(dǎo)ampC基因所占的比例。 (2)根據(jù)CLSI的標(biāo)準(zhǔn),采用K-B紙片擴(kuò)散法,進(jìn)行頭孢西丁紙片藥敏試驗(yàn)對(duì)54株大腸埃希菌進(jìn)行AmpC酶初篩。判斷標(biāo)準(zhǔn)為頭孢西丁(30μg/片)抑菌環(huán)直徑≤18mm為AmpC酶初篩陽(yáng)性。 (3)采用反復(fù)凍融的方法,粗提54株大腸埃希菌的AmpC酶,進(jìn)行三維試驗(yàn)篩選AmpC酶陽(yáng)性菌株。 (4)兩兩比較LAMP法、頭孢西丁紙片法和三維試驗(yàn)法對(duì)大腸埃希菌AmpC酶的檢測(cè)結(jié)果,評(píng)價(jià)LAMP在對(duì)耐藥基因檢測(cè)方面的臨床應(yīng)用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS13.0軟件包,進(jìn)行x2檢驗(yàn)和Kappa檢驗(yàn)處理,P0.05表示有顯著差異,K0.7表示吻合度較強(qiáng)。 三、結(jié)果 1、確定檢測(cè)大腸埃希菌mpC基因的LAMP反應(yīng)體系包括：2μlDNA模板,1.6μM內(nèi)引物(FIP和BIP),0.4μM外引物(F3和B3),0.4μM環(huán)引物(LF和LB),2.5μl10×Bst buffer,0.6mM dNTPs,1.0Mbetaine,12mMMgCl2,8U Bst DNA polymerase,補(bǔ)加ddH2O至25μ1。該體系在65℃下反應(yīng)60min,經(jīng)肉眼可觀察到明顯的白色沉淀,產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳分析,可看到典型的梯形條帶。 2、LAMP的特異性與PCR一致,靈敏度比PCR高出10倍左右。 3、采用LAMP和PCR兩種方法,分別對(duì)54株大腸埃希菌臨床分離株進(jìn)行檢查,兩種方法的結(jié)果完全一致,均檢出ampC基因陽(yáng)性菌株41株,占75.93%,陰性13株,占24.07%；并檢出由質(zhì)粒攜帶ampC基因的菌株21株,占38.89%。 4、頭孢西丁藥敏試驗(yàn)篩選出對(duì)頭孢西丁敏感的大腸埃希菌32株,耐藥22株。三維試驗(yàn)檢測(cè)出AmpC酶陽(yáng)性大腸埃希菌19株,陰性35株。其中耐藥菌株和AmpC酶陽(yáng)性菌株均為ampC基因陽(yáng)性,而ampC基因陰性的菌株均對(duì)頭孢西丁敏感且AmpC酶為陰性。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,LAMP與頭孢西丁紙片藥敏試驗(yàn)和三維試驗(yàn)之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000),吻合度較弱(K值分別為0.358和0.294)；頭孢西丁紙片藥敏試驗(yàn)和三維試驗(yàn)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.25),吻合度較強(qiáng)(K=0.882)。 四、結(jié)論 1、LAMP法可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)大腸埃希茵AmpC酶結(jié)構(gòu)基因ampC,且該方法無(wú)需特殊的儀器設(shè)備,操作簡(jiǎn)單,適于在基層推廣應(yīng)用。 2、LAMP法檢測(cè)ampC基因?yàn)殛幮缘?3株大腸埃希菌,頭孢西丁紙片藥敏試驗(yàn)和三維試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果均顯示AmpC酶為陰性；對(duì)頭孢西丁耐藥的22株大腸埃希菌和三維試驗(yàn)陽(yáng)性的19株大腸埃希菌,LAMP法檢測(cè)結(jié)果均顯示ampC基因?yàn)殛?yáng)性;ampC基因檢測(cè)為陽(yáng)性而AmpC酶檢測(cè)為陰性的大腸埃希茵,與抗生素作用后可能會(huì)誘導(dǎo)其表達(dá)AmpC酶并產(chǎn)生耐藥性。以上表明LAMP對(duì)ampC基因的檢測(cè),有助于指導(dǎo)臨床選擇合適的抗菌藥物,減少因錯(cuò)用、濫用抗生素而引起的細(xì)菌耐藥。 3、LAMP可檢測(cè)質(zhì)粒攜帶的ampC基因,有助于了解該耐藥基因的傳播速度和監(jiān)測(cè)其流行趨勢(shì)。
【關(guān)鍵詞】：大腸埃希菌 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) AmpC酶 頭孢西丁敏感試驗(yàn) 三維試驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378.21
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-29
• 第一部分 大腸埃希菌ampC基因LAMP檢測(cè)方法的建立29-42
• 1.1 材料29-30
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法30-34
• 1.3 結(jié)果34-39
• 1.4 討論39-42
• 第二部分 LAMP法檢測(cè)ampC基因的初步應(yīng)用42-51
• 2.1 材料42-43
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法43-46
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-49
• 2.4 討論49-51
• 全文總結(jié)51-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 綜述60-68
• 參考文獻(xiàn)65-68
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況68-69
• 中英文縮略詞表69-70
• 致謝70-71

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5 王欣慧;產(chǎn)AmpC酶的大腸埃希菌分子流行特征及PBP4在其耐藥機(jī)制中作用的探討[D];蘇州大學(xué);2012年

6 李莎;大腸埃希菌臨床分離菌株耐藥性及毒力基因分析[D];青島大學(xué);2012年

7 韓寧;濟(jì)南市周邊廢水環(huán)境中耐藥大腸埃希菌的分離、分布及其整合子在耐藥機(jī)制中的相關(guān)性研究[D];山東大學(xué);2012年

8 趙寶;陜西省致仔豬腹瀉大腸埃希菌的血清型、耐藥性及質(zhì)粒譜型研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

9 羅建華;產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌中氨基糖苷類修飾酶基因分布研究[D];浙江大學(xué);2011年

10 孔海深;致瀉大腸埃希菌的分子分型和流行病學(xué)研究[D];浙江大學(xué);2011年

  本文關(guān)鍵詞：大腸埃希菌ampC基因LAMP檢測(cè)方法的建立及其初步應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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