【摘要】：目的： 1.建立體外分離、培養(yǎng)、獲得人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hASCs)的方法,并對(duì)其形態(tài)、免疫表型、生物學(xué)特性進(jìn)行觀察和研究。 2.建立體外分離培養(yǎng)獲得人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)的方法,并對(duì)其形態(tài)、生物學(xué)特性進(jìn)行觀察和研究。 方法： 1.抽脂術(shù)獲得大量脂肪,用0.15%Ⅰ型膠原酶消化法獲得大量人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞行并進(jìn)行體外培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)特征；用CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)繪制生長(zhǎng)曲線；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)抗原；并分別進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)分化鑒定其多向分化潛能。 2.將獲取的新鮮胎兒臍帶使用0.2%Ⅰ型膠原酶消化法獲得大量臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞行并進(jìn)行體外培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)特征,并通過(guò)DiI-Ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。 結(jié)果： 1.通過(guò)分離培養(yǎng),獲得了大量旋渦狀生長(zhǎng)的成纖維樣細(xì)胞。CCK-8法顯示細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。流式鑒定結(jié)果顯示細(xì)胞表面CD2、CD44陽(yáng)性；CD45、HLA-DR陰性。培養(yǎng)的細(xì)胞在特定誘導(dǎo)條件下,具有向骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的潛能。證明該方法所培養(yǎng)的細(xì)胞為臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。 2.通過(guò)分離培養(yǎng),獲得了大量鵝卵石樣細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察其具有攝取DiI-Ac-LDL的能力,證明該方法所培養(yǎng)的細(xì)胞為臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。 結(jié)論： 建立了高效穩(wěn)定的分離、培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的方法,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了種子細(xì)胞。 目的： 通過(guò)應(yīng)用糖基化工程,體外巖藻糖基化處理人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hASCs),將其表面的CD44分子轉(zhuǎn)換為HCELL分子,從而提高h(yuǎn)ASCs與E選擇素結(jié)合能力,為功能研究及體內(nèi)研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 建立α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶以及相應(yīng)底物的酶化體系。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)1ASCs表面粘附因子的表達(dá)情況。將巖藻糖基化處理后的]ASCs進(jìn)行體外功能試驗(yàn),包括流式細(xì)胞技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、靜態(tài)及動(dòng)態(tài)粘附試驗(yàn),驗(yàn)證其唾液酸化LewisX (sLex)的表達(dá)及具有E選擇素結(jié)合能力。并使用臺(tái)酚藍(lán)染色法、CCK-8法、誘導(dǎo)分化檢測(cè)巖藻糖基化處理是否影響細(xì)胞的增殖、活性及多向分化能力。 結(jié)果： 流式結(jié)果顯示未處理的hASCs高表達(dá)CD29、CD44、CD49d、CD49e,低表達(dá)或者不表達(dá)唾液酸化LewisX (sLeX)、PSGL-1、CXCR4、β7,無(wú)E選擇素結(jié)合力。然而,經(jīng)過(guò)體外巖藻糖基化處理后的hASCs高表達(dá)sLex,E選擇素結(jié)合力顯著升高。免疫印跡法也證實(shí)了這一結(jié)果。靜態(tài)及動(dòng)態(tài)粘附實(shí)驗(yàn)均證明與未處理組相比,巖藻糖基化處理后的hASCs在靜態(tài)及動(dòng)態(tài)條件下,對(duì)E選擇素結(jié)合力顯著升高。同時(shí),我們還證實(shí)了巖藻糖基化處理不會(huì)影響細(xì)胞的增殖、活性及多向分化能力。 結(jié)論： 巖藻糖基化處理后的hASCs高表達(dá)sLex,并顯著增加E選擇素結(jié)合力,并不會(huì)影響細(xì)胞的增殖、活性及多向分化能力。 目的：通過(guò)體外巖藻糖基化處理hASCs,使其表面強(qiáng)制表達(dá)HCELL分子,從而提高h(yuǎn)ASCs的E選擇素結(jié)合能力,最終促進(jìn)其向骨歸巢能力。 方法： 1.將DiI熒光標(biāo)記過(guò)的巖藻糖基化處理后hASCs通過(guò)尾靜脈回輸至NOD/SCID小鼠體內(nèi),16小時(shí)后將處死小鼠,取得股骨骨髓,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DiI陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。 2.將巖藻糖基化處理后hASCs通過(guò)尾靜脈回輸至NOD/SCID小鼠體內(nèi),3個(gè)月后將小鼠處死,取出顱骨脫鈣,OCT包埋,制成冰凍切片。運(yùn)用免疫熒光法檢測(cè)歸巢ASCs的定植位置及成骨分化能力。 結(jié)果： 1.流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示：巖藻糖基化處理組的骨髓內(nèi)DiI染色陽(yáng)性細(xì)胞的所占比例約為0.77+0.10%；未處理組的骨髓內(nèi)DiI染色陽(yáng)性細(xì)胞的所占比例約為0.09+0.02%。上述結(jié)果表明,巖藻糖基化處理可以顯著提高h(yuǎn)ASCs的短期歸巢能力。 2.通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察到的免疫熒光結(jié)果顯示：巖藻糖基化組的小鼠顱骨骨內(nèi)膜表面可以觀察到稀少的人骨鈣素陽(yáng)性的成骨細(xì)胞,而在未處理組及對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)人骨鈣素陽(yáng)性的細(xì)胞。上述結(jié)果證明經(jīng)過(guò)巖藻糖基化處理后的hASCs不僅能夠促進(jìn)其向骨歸巢能力,并仍能保留其向成骨分化的能力。 結(jié)論： 巖藻糖基化處理可以顯著提高h(yuǎn)ASCs在NOD/SCID小鼠體內(nèi)的向骨歸巢能力,并定植于骨內(nèi)膜表面,仍具有自我更新及成骨分化能力。這為為其在組織再生修復(fù)中進(jìn)一步的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
【圖文】：

約10-14d后細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底80%左右時(shí)，此時(shí)可進(jìn)行細(xì)胞傳代。傳代后的hASCs呈分布均一的長(zhǎng)梭形(圖1)。 , ^ -差_圖1第三代人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(xioo)Figl The third generation hASCs(xlOO)2.2 hASCs的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)CCIC-8結(jié)果示，hASCs傳代培養(yǎng)后第2天細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增殖期，第4天進(jìn)入平臺(tái)期18

流式結(jié)果顯示：hASCs高表達(dá)CD29、CD44、CD49d、CD49e，低表達(dá)或者不表達(dá)唾液酸化LewisX (sLeX)、PSGL-1、CXCR4、P 7,無(wú)E選擇素結(jié)合力(圖9)。. E-lg 5 丨 CSLEX.1 5, CD44A 丨/\ A 1\I / \ ： j \ N {\) \ \J\ n i\? ‘ ?‘ . V f <t' f ,?■ ??? *4? 'V ' * ‘ "?‘ “ St"s PSGL-1 -- CXCR4 J CD29-? . . hI i\\ \

本文編號(hào)：2744865