【摘要】： 作為基因轉染載體，陽離子脂質體雖然具有許多優(yōu)點，但其仍然存在基因轉染效率較低、易受多種因素影響等問題，因此人們在不斷的尋找和研究新的、基因轉染效率高而穩(wěn)定的陽離子脂質體。人β防御素2(hBD-2)是人體細胞分泌的具有抗微生物活性的短肽，在皮膚、肺部粘膜的防御上起著重要的作用。本研究主要目的是①通過有機化學合成法合成制備新的高基因轉染效率的陽離子脂質體，對其在體外培養(yǎng)細胞和體內細胞的轉染條件和模式進行篩選和評估；②建立呼吸道霧化吸入的基因轉染模式；③用人工合成的方法合成hBD-2的結構基因并構建其重組真核表達載體；④利用新型陽離子脂質體將hBD-2重組真核表達載體轉染至體內、外氣道上皮細胞，對其表達進行研究，以尋求一個可行的新的抗感染基因治療途徑。 方法：(1)用有機化學合成法合成新型細胞轉染素：N4-精胺膽固醇羰酰氨，并對其結構進行鑒定。(2)采用薄膜法制備以N4-精胺膽固醇羰酰氨為陽性成分的新型陽離子脂質體，通過電鏡觀察、凝膠電泳確定轉染條件，并用熒光質粒載體對肺腺癌SPC細胞進行轉染，評估其轉染效率。(3)根據(jù)Genebank中的hBD-2結構基因序列，設計合成三條長鏈引物，用PCR延伸擴增的方法合成hBD-2基因；用雙酶切定向克隆的方法構建重組真核表達載體pLXSN-hBD2。(4)用重組真核表達載體pLXSN-hBD2通過新型陽離子脂質體對大鼠氣道上皮細胞進行轉染，用PCR、Western blot檢測hBD-2基因的整合與表達。(5)通過霧化吸入模式對新型陽離子脂質體在體內轉染pLXSN-hBD2進行研究。 結果：(1)成功合成出新型細胞轉染素N4-精胺膽固醇羰酰氨，質譜儀、紅外光譜儀、核磁共振分析證明結構正確。(2)電鏡下顯示用薄膜法制備的新型陽離子脂質體為0.1μm -1μm的圓形微囊泡結構，在濃度為0.25mg/ml、脂質體/質粒為6-8:1左右時轉染效率高達60.5%。(3)凝膠電泳及測序分析結果顯示，PCR延伸擴增法合成的hBD-2基因與原序列一致，并成功克隆到真核表達載體pLXSN上。(4)重組載體pLXSN-hBD2與大鼠氣道上皮細胞基因組DNA成功整合，并成功獲得表達。(5)新型陽離子脂質體通過霧化吸入將pLXSN-hBD2質粒轉染進體內氣道上皮細胞并獲得表達，轉染后2天、6天和15天的Western blot檢測結果表明hBD-2有持續(xù)表達，且逐漸降低，到21天基本結束。 WP=8 結論：(1)通過有機化學的方法，合成了高純度的目標化合物N4-精胺膽固醇羰酰氨。(2)成功制備了以N4-精胺膽固醇羰酰氨為陽性成分的新型陽離子脂質體，并且該脂質體在適當條件下具有良好的轉染活性。(3)成功合成hBD-2基因并構建其重組真核表達載體。(4)通過新型陽離子脂質體，重組真核表達載體pLXSN-hBD2被成功整合進體外培養(yǎng)的大鼠氣道上皮細胞基因組DNA中，并表達hBD-2。(5)通過霧化吸入能將pLXSN-hBD2質粒轉染進大鼠體內氣道上皮細胞并獲得表達，并且hBD-2的表達能持續(xù)一段時間。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R346
【圖文】：

圖 5 不同比例脂質體/質粒復合體電泳脂質體與質粒重量比分別是：1:1、2:1、3:1、 1:1-4:1 時，質粒條帶幾乎在同一位置于 6:1 時則無條帶出現(xiàn)。說明新合成的陽性電荷，對質粒的遷移有影響，在重荷。處理的陽離子脂質體為微囊泡結構，多為主，大小在 100nm-1.0μm 之間， 以l 左右時，形態(tài)及大小較為規(guī)則、均勻形態(tài)(見照片 1、2)。但隨著濃度越高，)。質體轉染效率的測定

第三軍醫(yī)大學博士學位論文，以及利用霧化吸入對大鼠體內氣管上內細胞中的轉染和表達，為 hBD-2 的應防御素-2 基因的合成及其真核表材料和方法:逆轉錄病毒真核表達載體 pLXSN 為主細菌-大腸桿菌 X-blue 為我所保存菌

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