【摘要】： 作為基因轉(zhuǎn)染載體，陽離子脂質(zhì)體雖然具有許多優(yōu)點(diǎn)，但其仍然存在基因轉(zhuǎn)染效率較低、易受多種因素影響等問題，因此人們?cè)诓粩嗟膶ふ液脱芯啃碌�、基因轉(zhuǎn)染效率高而穩(wěn)定的陽離子脂質(zhì)體。人β防御素2(hBD-2)是人體細(xì)胞分泌的具有抗微生物活性的短肽，在皮膚、肺部粘膜的防御上起著重要的作用。本研究主要目的是①通過有機(jī)化學(xué)合成法合成制備新的高基因轉(zhuǎn)染效率的陽離子脂質(zhì)體，對(duì)其在體外培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件和模式進(jìn)行篩選和評(píng)估；②建立呼吸道霧化吸入的基因轉(zhuǎn)染模式；③用人工合成的方法合成hBD-2的結(jié)構(gòu)基因并構(gòu)建其重組真核表達(dá)載體；④利用新型陽離子脂質(zhì)體將hBD-2重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至體內(nèi)、外氣道上皮細(xì)胞，對(duì)其表達(dá)進(jìn)行研究，以尋求一個(gè)可行的新的抗感染基因治療途徑。 方法：(1)用有機(jī)化學(xué)合成法合成新型細(xì)胞轉(zhuǎn)染素：N4-精胺膽固醇羰酰氨，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。(2)采用薄膜法制備以N4-精胺膽固醇羰酰氨為陽性成分的新型陽離子脂質(zhì)體，通過電鏡觀察、凝膠電泳確定轉(zhuǎn)染條件，并用熒光質(zhì)粒載體對(duì)肺腺癌SPC細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，評(píng)估其轉(zhuǎn)染效率。(3)根據(jù)Genebank中的hBD-2結(jié)構(gòu)基因序列，設(shè)計(jì)合成三條長(zhǎng)鏈引物，用PCR延伸擴(kuò)增的方法合成hBD-2基因；用雙酶切定向克隆的方法構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pLXSN-hBD2。(4)用重組真核表達(dá)載體pLXSN-hBD2通過新型陽離子脂質(zhì)體對(duì)大鼠氣道上皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用PCR、Western blot檢測(cè)hBD-2基因的整合與表達(dá)。(5)通過霧化吸入模式對(duì)新型陽離子脂質(zhì)體在體內(nèi)轉(zhuǎn)染pLXSN-hBD2進(jìn)行研究。 結(jié)果：(1)成功合成出新型細(xì)胞轉(zhuǎn)染素N4-精胺膽固醇羰酰氨，質(zhì)譜儀、紅外光譜儀、核磁共振分析證明結(jié)構(gòu)正確。(2)電鏡下顯示用薄膜法制備的新型陽離子脂質(zhì)體為0.1μm -1μm的圓形微囊泡結(jié)構(gòu)，在濃度為0.25mg/ml、脂質(zhì)體/質(zhì)粒為6-8:1左右時(shí)轉(zhuǎn)染效率高達(dá)60.5%。(3)凝膠電泳及測(cè)序分析結(jié)果顯示，PCR延伸擴(kuò)增法合成的hBD-2基因與原序列一致，并成功克隆到真核表達(dá)載體pLXSN上。(4)重組載體pLXSN-hBD2與大鼠氣道上皮細(xì)胞基因組DNA成功整合，并成功獲得表達(dá)。(5)新型陽離子脂質(zhì)體通過霧化吸入將pLXSN-hBD2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)體內(nèi)氣道上皮細(xì)胞并獲得表達(dá)，轉(zhuǎn)染后2天、6天和15天的Western blot檢測(cè)結(jié)果表明hBD-2有持續(xù)表達(dá)，且逐漸降低，到21天基本結(jié)束。 WP=8 結(jié)論：(1)通過有機(jī)化學(xué)的方法，合成了高純度的目標(biāo)化合物N4-精胺膽固醇羰酰氨。(2)成功制備了以N4-精胺膽固醇羰酰氨為陽性成分的新型陽離子脂質(zhì)體，并且該脂質(zhì)體在適當(dāng)條件下具有良好的轉(zhuǎn)染活性。(3)成功合成hBD-2基因并構(gòu)建其重組真核表達(dá)載體。(4)通過新型陽離子脂質(zhì)體，重組真核表達(dá)載體pLXSN-hBD2被成功整合進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠氣道上皮細(xì)胞基因組DNA中，并表達(dá)hBD-2。(5)通過霧化吸入能將pLXSN-hBD2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)大鼠體內(nèi)氣道上皮細(xì)胞并獲得表達(dá)，并且hBD-2的表達(dá)能持續(xù)一段時(shí)間。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R346
【圖文】：

圖 5 不同比例脂質(zhì)體/質(zhì)粒復(fù)合體電泳脂質(zhì)體與質(zhì)粒重量比分別是：1:1、2:1、3:1、 1:1-4:1 時(shí)，質(zhì)粒條帶幾乎在同一位置于 6:1 時(shí)則無條帶出現(xiàn)。說明新合成的陽性電荷，對(duì)質(zhì)粒的遷移有影響，在重荷。處理的陽離子脂質(zhì)體為微囊泡結(jié)構(gòu)，多為主，大小在 100nm-1.0μm 之間， 以l 左右時(shí)，形態(tài)及大小較為規(guī)則、均勻形態(tài)(見照片 1、2)。但隨著濃度越高，)。質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文，以及利用霧化吸入對(duì)大鼠體內(nèi)氣管上內(nèi)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染和表達(dá)，為 hBD-2 的應(yīng)防御素-2 基因的合成及其真核表材料和方法:逆轉(zhuǎn)錄病毒真核表達(dá)載體 pLXSN 為主細(xì)菌-大腸桿菌 X-blue 為我所保存菌

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本文編號(hào)：2742828