【摘要】：第一部分沙眼衣原體分泌性糖脂(GLXA)對iNKT細(xì)胞激活作用的研究 研究目的 衣原體(Chlamydiae)是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生,有獨(dú)特發(fā)育周期的原核細(xì)胞型微生物,衣原體感染與許多人類疾病有著密切聯(lián)系。根據(jù)基因型的不同,衣原體可分為沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis, Ct)和肺炎衣原體(Chlamydia pneumonias, Cpn)兩個種屬。其中沙眼衣原體主要引起呼吸道感染、眼部粘膜感染及性傳播疾病。最近,沙眼衣原體中的鼠類變種株被單獨(dú)劃分出來,被命名為衣原體鼠肺炎株(Chlamydia muridarum, Cm),該株廣泛用于建立小鼠肺部或生殖道感染模型,進(jìn)行沙眼衣原體致病機(jī)制的理論研究。而肺炎衣原體主要引起支氣管炎、鼻竇炎、肺炎等呼吸道疾病。雖然抗生素可有效控制衣原體的感染癥狀,但是衣原體感染的臨床表現(xiàn)具有多樣性,大多數(shù)以隱性感染的形式存在,被感染者不能及時就診,使得抗生素對感染的控制力大大減弱,因此,研發(fā)安全有效的疫苗對控制衣原體感染意義重大,目前尚無有效的疫苗預(yù)防和(或)治療衣原體感染。闡明衣原體感染過程中免疫保護(hù)和免疫病理的機(jī)制是合理研制安全有效衣原體疫苗的首要條件。 自然殺傷性T細(xì)胞(invariant natural killer T cell, iNKT)作為獨(dú)特的T細(xì)胞亞群識別由非經(jīng)典的MHCI類分子CD1d遞呈的糖脂類抗原,而不是肽類抗原。研究表明,在衣原體感染中iNKT細(xì)胞被激活并產(chǎn)生細(xì)胞因子,通過其對獲得性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)在衣原體感染的進(jìn)程和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。衣原體分泌性糖脂抗原(glycolipid exoantigen, GLXA)是目前已被報道的一種和衣原體感染相關(guān)的糖脂抗原,但GLXA能否活化NKT細(xì)胞,以及它是否是衣原體感染中對iNKT細(xì)胞作用的關(guān)鍵抗原尚不清楚。因此,本研究擬證實(shí)GLXA能否在體內(nèi)外激活iNKT細(xì)胞,進(jìn)一步明確衣原體感染的免疫機(jī)制,為以GLXA為靶點(diǎn)的衣原體疫苗的研制奠定理論基礎(chǔ)。 研究方法 提取衣原體培養(yǎng)上清中的分泌性糖脂,并以相同的方法提取未感染細(xì)胞培養(yǎng)上清中的脂類(cell mock)作為實(shí)驗(yàn)對照,對糖脂成分進(jìn)行銀染顯色和Western Blot鑒定分析。為驗(yàn)證該糖脂是否能夠激活iNKT細(xì)胞,采用了體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)分別進(jìn)行驗(yàn)證： 1.體外實(shí)驗(yàn)： 1) CDld蛋白+NKT雜交瘤共培養(yǎng)系統(tǒng)：用CDld融合蛋白包被96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,然后在板中加入GLXA和NKT雜交瘤進(jìn)行共培養(yǎng),ELISA檢測培養(yǎng)上清中IL-2的水平,以明確GLXA能否活化NKT雜交瘤細(xì)胞。 2)體外共培養(yǎng)系統(tǒng)：制備小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(DC),經(jīng)糖脂沖擊樹突狀細(xì)胞24小時后,與肝臟單個核細(xì)胞(LMC)共培養(yǎng),48小時后收集培養(yǎng)上清ELISA法檢測細(xì)胞因子IFN-y和IL-4。并在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中采用iNKT缺陷小鼠以及CD1d抗體封閉系統(tǒng)進(jìn)一步驗(yàn)證作用機(jī)制。 2.體內(nèi)試驗(yàn)： 1)靜脈注射：采用C57BL/6(WT)小鼠和iNKT缺陷小鼠,分別經(jīng)尾靜脈注射給予GLXA,注射后2h對小鼠取血,用ELISA檢測血清中IL-4的表達(dá)水平,注射后12h取血,用ELISA檢測血清中IFN-y的表達(dá)水平。 2)腹腔注射：小鼠腹腔注射GLXA,用流式細(xì)胞術(shù)分析其對iNKT表面活化標(biāo)志及細(xì)胞因子分泌的影響。 研究結(jié)果 1.糖脂鑒定：銀染顯色和Western Blot分析顯示,提取的衣原體分泌性糖脂與文獻(xiàn)報道的GLXA條帶一致,與cell mock實(shí)驗(yàn)對照組形成的條帶明顯不同。 2.體外實(shí)驗(yàn)： 1)CDld蛋白+NKT雜交瘤共培養(yǎng)系統(tǒng)：與對照組相比,GLXA可特異性活化NKT雜交瘤細(xì)胞,使其產(chǎn)生IL-2。 2)體外共培養(yǎng)系統(tǒng)：GLXA沖擊組產(chǎn)生的IFN-γ和IL-4均高于cell mock沖擊組及陰性對照組(DC未經(jīng)抗原刺激),表明分泌性糖脂能夠激活LMC產(chǎn)生細(xì)胞因子。為進(jìn)一步驗(yàn)證LMC產(chǎn)生的IFN-γ和IL-4主要來源于iNKT細(xì)胞,在DC-LMC共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中采用了iNKT缺陷小鼠以及CD1d抗體封閉,結(jié)果顯示：(1)來源于iNKT缺陷小鼠LMC產(chǎn)生的IFN-γ和IL-4均顯著低于野生型小鼠.(2)加入CD1d抗體封閉后,野生型小鼠LMC產(chǎn)生IFN-γ和IL-4也明顯下降。由此證明衣原體分泌性糖脂誘導(dǎo)的細(xì)胞因子主要由iNKT細(xì)胞產(chǎn)生,而且此作用部分依賴于CDld分子。 3.體內(nèi)試驗(yàn)： 1)靜脈注射：在給予GLXA刺激的野生型小鼠血清中,可檢測出較高水平的IFN-γ和IL-4,在iNKT缺陷小鼠中卻沒有發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象,說明血清中較高水平的IFN-γ和IL-4主要是由iNKT細(xì)胞產(chǎn)生的,而且是GLXA促進(jìn)iNKT細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。 2)腹腔注射：通過流式細(xì)胞術(shù)檢測,與對照組相比GLXA可明顯提高iNKT細(xì)胞表面活化標(biāo)志的表達(dá),并促進(jìn)其分泌細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4,說明其對iNKT細(xì)胞有明顯的激活作用。 研究結(jié)論 以上實(shí)驗(yàn)證明,衣原體分泌性糖脂GLXA能夠激活iNKT細(xì)胞并產(chǎn)生細(xì)胞因子,并且該活化作用在一定程度上依賴CDld分子的遞呈作用,GLXA可能是衣原體感染中iNKT細(xì)胞活化的關(guān)鍵抗原,有關(guān)GLXA激活iNKT細(xì)胞的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。 研究意義 該研究進(jìn)一步完善了我們對衣原體致病機(jī)制的認(rèn)識,加深了衣原體感染引起的宿主免疫反應(yīng)機(jī)制的了解,為以GLXA為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)疫苗抵抗衣原體感染奠定了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。 第二部分白細(xì)胞介素-22在衣原體肺部感染中的生物學(xué)作用 研究目的 白細(xì)胞介素-22(IL-22)是IL-10細(xì)胞因子家族的一員,它是一種炎癥因子,在調(diào)控組織局部免疫方面起著重要的作用。近期的研究證實(shí),IL-22在抵抗細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲感染所引發(fā)的宿主免疫中起到一定保護(hù)作用。目前普遍接受的觀點(diǎn)是IL-22在枸櫞酸桿菌、克雷伯桿菌、分節(jié)絲狀桿菌等胞外菌引起的感染中起到保護(hù)作用,但是IL-22在宿主抵抗胞內(nèi)菌感染中的作用目前仍不明確。因此進(jìn)一步在胞內(nèi)菌感染模型中評估IL-22的作用是十分必要的,這有利于明確IL-22在胞內(nèi)菌感染中的生物學(xué)效應(yīng),并為其提供更充分的理論學(xué)依據(jù)。 衣原體是專性胞內(nèi)寄生菌,其中對人類致病的種屬是沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis, Ct)和肺炎衣原體(Chlamydia pneumonia, Cpn)。沙眼衣原體主要引起呼吸道、眼睛及性疾病的傳播。肺炎衣原體主要引起支氣管炎、鼻竇炎和肺炎。由于衣原體菌株具有一定的種屬特異性,近些年引起小鼠肺炎的菌株被單獨(dú)劃分出來稱為鼠肺炎衣原體(Chlamydia muridarum, Cm)。目前在實(shí)驗(yàn)研究中,鼠肺炎衣原體株被廣泛用于小鼠呼吸道和生殖道感染模型中。在小鼠呼吸道感染模型中,目前的研究證實(shí)Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)起到主要的保護(hù)作用,可有效控制衣原體感染,對疾病的轉(zhuǎn)歸起到?jīng)Q定性作用。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)Th17在宿主防御衣原體感染中也起到重要的作用,它可以促進(jìn)Thl型細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此,Thl和Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)對于宿主清除病原菌起到重要的促進(jìn)作用。IL-22和IL-17是Th17細(xì)胞亞群主要產(chǎn)生的細(xì)胞因子,它們在許多感染模型中都起到相互協(xié)同的作用。迄今為止,沒有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)IL-22在小鼠肺部衣原體感染中的作用。在本研究中,我們擬用抗小鼠IL-22單克隆抗體封閉小鼠體內(nèi)固有產(chǎn)生的IL-22,從而進(jìn)一步評估IL-22在小鼠肺部衣原體感染中的作用。 研究方法 1、IL-22抗體封閉實(shí)驗(yàn)：在小鼠Cm肺感染模型中,用小鼠IL-22單克隆抗體對肺局部的IL-22進(jìn)行封閉,以檢測IL-22的作用。 1)流式細(xì)胞術(shù)：檢測Th1、Th17、Treg等細(xì)胞亞群的變化情況。 2) ELISA:檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-17、IFN-y等細(xì)胞因子的表達(dá)水平 3) RT-PCR:檢測IL-22、IL-17、IFN-y、T-bet、RORyt在RNA水平上的變化情況。 4)HE染色：肺組織切片鏡檢。 2、IL-22蛋白給予實(shí)驗(yàn)：在小鼠Cm肺感染模型中,肺局部給予小鼠純化IL-22蛋白,以檢測IL-22對疾病轉(zhuǎn)歸的影響。 1)流式細(xì)胞術(shù)：檢測Th1、Th17等細(xì)胞亞群的變化情況。 2) ELISA:檢測培養(yǎng)上清中IL-17、IFN-γ等細(xì)胞因子的表達(dá)水平。 3)HE染色：肺組織切片鏡檢。 研究結(jié)果 1、IL-22抗體封閉實(shí)驗(yàn)：IL-22在小鼠Cm肺部感染的早期階段就有升高表達(dá),用抗體將其封閉后結(jié)果如下：與同型對照組相比,IL-22抗體封閉組的肺部炎癥更加嚴(yán)重,表現(xiàn)為體重下降更明顯,負(fù)菌量升高,病理組織切片炎癥浸潤更加明顯。流式分析顯示IL-22抗體封閉組的Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)降低,而CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群增高,此外IL-10的生成也隨著IL-22的封閉而減少。 2、IL-22蛋白給予實(shí)驗(yàn)：將IL-22純化蛋白給予Cm肺部感染的小鼠后,很好地控制了肺部炎癥的發(fā)展和衣原體的增殖,并促進(jìn)了肺部的Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)。 研究結(jié)論 IL-22產(chǎn)生并高表達(dá)于小鼠Cm肺部感染的早期階段,可以保護(hù)機(jī)體減輕衣原體的肺部感染。IL-22這種保護(hù)性作用主要是通過促進(jìn)Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。 研究意義 IL-22作為一種重要的炎癥因子參與了機(jī)體防御衣原體肺部感染的進(jìn)程,它對機(jī)體起到明顯的保護(hù)作用,本研究為以IL-22為靶點(diǎn)研發(fā)新藥控制衣原體肺部感染提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R374

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本文編號：2742878