本文關(guān)鍵詞：H19通過干擾hnRNPU-actin復(fù)合物抑制RNA聚合酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：H19作為最早被發(fā)現(xiàn)和研究的少數(shù)幾個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA分子之一,大量的研究提示H19與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。然而H19的具體生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制,尤其是對(duì)轉(zhuǎn)錄過程是否存在調(diào)節(jié)作用尚不清楚。因此探討H19可能的生物學(xué)功能及其具體作用的分子機(jī)制可以為H19在生理及病理環(huán)境中的重要作用提供線索,帶著這些問題我們展開了本課題的研究。 首先,我們進(jìn)行了RNA pulldown實(shí)驗(yàn),將H19全長(zhǎng)及其反義鏈構(gòu)建到pSPTl9載體上,體外轉(zhuǎn)錄獲得H19正義鏈和反義鏈RNA后,檢測(cè)濃度符合要求后冷凍保存。另外,收集肝癌細(xì)胞Hep3B和Huh-7的全蛋白待用。利用準(zhǔn)備好的上述樣品進(jìn)行最終的RNA pulldown實(shí)驗(yàn),對(duì)比正義鏈和反義鏈的差異蛋白條帶做質(zhì)譜鑒定后,結(jié)果顯示H19的相互作用蛋白為核不均一核糖核蛋白(heterogeneous ribonucleopro-tein) hnRNP U。對(duì)質(zhì)譜鑒定的結(jié)果通過Western blotting、RIP驗(yàn)證。在兩者的結(jié)合確定后,為了進(jìn)一步探明H19的哪個(gè)區(qū)域與hnRNP U結(jié)合,我們H19構(gòu)建了H19不同區(qū)域截短體,通過截短體實(shí)驗(yàn)證明與hnRNP U結(jié)合的區(qū)域位于H19的5’端882nt。 在確定與H19相互作用的蛋白為hnRNP U后,接下來我們便從hnRNP U這個(gè)RNA/DNA結(jié)合蛋白切入,探索H19的生理、病理學(xué)功能及其作用機(jī)制。在查閱相關(guān)文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn),hnRNP U能與不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合發(fā)揮不同的功能。而更加值得關(guān)注的是hnRNPU在RNA聚合酶Ⅱ介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄中也發(fā)揮重要的功能。研究報(bào)道,hnRNP U和actin結(jié)合通過促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ CTD的磷酸化進(jìn)而促進(jìn)RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄�；谝陨系难芯拷Y(jié)果的提示,我們首先想證實(shí)H19對(duì)RNA聚合酶Ⅱ介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄是否有調(diào)控作用。在Hep3B和Huh-7細(xì)胞中進(jìn)行了EU摻入實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相對(duì)于對(duì)照組過表達(dá)H19組EU摻入減少,以上結(jié)果提示H19抑制了RNA聚合酶Ⅱ介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。 在得出以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果后新的問題需要我們?nèi)プC實(shí)：H19通過怎樣的機(jī)制抑制RNA聚合酶Ⅱ介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄,H19是否會(huì)對(duì)hnRNP U-actin復(fù)合物有影響。我們利用IP實(shí)驗(yàn)對(duì)以上假設(shè)進(jìn)行檢驗(yàn),在Hep3B和Huh-7細(xì)胞中過表達(dá)H19,隨著H19濃度的升高h(yuǎn)nRNP U和actin勺結(jié)合呈下降趨勢(shì)。以上結(jié)果說明H19干擾了hnRNP U-actin復(fù)合物。那么H19對(duì)RNA聚合酶Ⅱ CTD的磷酸化過程是否有調(diào)控作用,因此我們分別用RNA聚合酶Ⅱ CTD2位、5位絲氨酸磷酸化及RNA聚合酶Ⅱ總CTD的抗體,相對(duì)于對(duì)照檢測(cè)過表達(dá)H19對(duì)這幾種形式蛋白的影響,Western blotting的結(jié)果顯示H19抑制RNA聚合酶Ⅱ CTD的5位絲氨酸的磷酸化。而在過表達(dá)hnRNPU的基礎(chǔ)上同時(shí)過表達(dá)H19時(shí),以上的生物學(xué)效應(yīng)明顯減弱,這說明H19的以上生物學(xué)功能是依賴hnRNPU實(shí)現(xiàn)的。 綜上所述，本課題研究對(duì)H19在肝癌細(xì)胞的生物學(xué)功能進(jìn)行了檢測(cè),探討了H19與hnRNP U的結(jié)合及其在肝癌細(xì)胞中的抑制RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的作用,進(jìn)一步完善了H19在肝癌細(xì)胞中的功能及其作用的機(jī)制研究,可能為H19的進(jìn)一步研究提供線索和依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：CTD磷酸化 EU摻入 H19 hnRNP U 轉(zhuǎn)錄抑制
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 縮略詞表9-11
• 前言11-13
• 材料和方法13-34
• 一、實(shí)驗(yàn)試劑13-15
• 二、主要材料15-16
• 三、實(shí)驗(yàn)方法16-34
• 結(jié)果34-43
• 一、H19的相互作用蛋白為hnRNP U34-36
• 二、H19的5’端882 nt對(duì)與hnRNPU的結(jié)合是必需的36-37
• 三、肝癌細(xì)胞中H19抑制RNA聚合酶Ⅱ介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄37-38
• 四、H19干擾hnRNP U-actin的結(jié)合38-39
• 五、H19抑制RNA聚合酶ⅡCTD Ser5磷酸化39-40
• 六、H19下調(diào)部分RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)水平40-41
• 七、hnRNP U對(duì)于H19介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制是必需的41-43
• 討論43-44
• 附錄44-50
• 綜述50-63
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明63-64
• 致謝64

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：H19通過干擾hnRNPU-actin復(fù)合物抑制RNA聚合酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：274117