本文關(guān)鍵詞：穩(wěn)定表達(dá)牛胰蛋白酶的MDCK細(xì)胞的構(gòu)建及對(duì)流感病毒增殖影響的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：流感疫苗是目前預(yù)防流感發(fā)生和傳播最為有效的手段。傳統(tǒng)的雞胚生產(chǎn)流感疫苗系統(tǒng)存在些不足之處，比如培養(yǎng)的流感病毒易發(fā)生抗原變異，與人群流行株不能完全匹配；殘留卵清蛋白易引起過(guò)敏反應(yīng)；尤其當(dāng)出現(xiàn)大流行時(shí)健康雞胚供應(yīng)受限不能滿足短時(shí)間內(nèi)對(duì)疫苗的大量需求。而哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)能夠避免這些問(wèn)題，成為未來(lái)疫苗生產(chǎn)的發(fā)展趨勢(shì)。臨床試驗(yàn)表明使用MDCK等細(xì)胞生產(chǎn)的流感疫苗是安全的并有高免疫原性，然而較低的病毒滴度是其大規(guī)模生產(chǎn)的瓶頸之。流感病毒血凝素HA被宿主蛋白酶裂解為成熟的HA1和HA2，才能夠介導(dǎo)病毒囊膜與靶細(xì)胞膜融合，起始病毒生命周期，因此HA的裂解是病毒感染細(xì)胞的首要前提，而MDCK細(xì)胞本身并不具備裂解HA的蛋白酶類，成為產(chǎn)量提升的限制因素。研究證明外加胰蛋白酶能夠有效地提高病毒產(chǎn)量，本研究采取基因工程手段將胰蛋白酶基因?qū)隡DCK細(xì)胞，構(gòu)建能夠自主表達(dá)裂解病毒的蛋白酶的細(xì)胞系，用于疫苗規(guī)模化生產(chǎn)，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝或更加有效地使疫苗產(chǎn)量提升。 胰蛋白酶本身存在酶原和酶兩種形式，而自然狀態(tài)人呼吸道上皮細(xì)胞中，蛋白酶裂解HA可能發(fā)生在胞外、胞內(nèi)或與胞膜相關(guān)，為此我們構(gòu)建了酶原和酶兩種形式，分泌、胞內(nèi)、跨膜3種細(xì)胞分布的共6種真核表達(dá)載體。基因合成了完整的牛胰蛋白酶表達(dá)序列，設(shè)計(jì)引物去除N端分泌信號(hào)肽或酶原激活肽的核苷酸序列，PCR擴(kuò)增并克隆了分泌型酶原和酶、胞內(nèi)型酶原和酶的表達(dá)序列；借鑒跨膜絲氨酸蛋白酶HAT基因的跨膜區(qū)TM，設(shè)計(jì)引物使TM和胰酶基因各有部分序列重疊，采用重疊PCR擴(kuò)增克隆出跨膜型酶原和酶的目的基因。6條目的序列引入Kozak序列和NheI和EcoRI酶切位點(diǎn)，保持正確的開放閱讀框，雙酶切連接至pcDNA3.1真核表達(dá)載體，從而構(gòu)建了3種細(xì)胞分布2種酶型的真核重組表達(dá)質(zhì)粒。 大量提取無(wú)內(nèi)毒素高純度的表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，建立了目的基因的瞬時(shí)表達(dá)體系。免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明載體成功表達(dá)且表達(dá)蛋白大小符合預(yù)期，分別為分泌酶原24.3kD、分泌酶23.4kD、胞內(nèi)酶原24.3kD、胞內(nèi)酶23.4kD、跨膜酶原30.2kD、跨膜酶29.2kD。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示表達(dá)亞細(xì)胞分布正確。以特異熒光底物法檢測(cè)各型表達(dá)蛋白酶活性發(fā)現(xiàn)分泌型酶原的活性最高，轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒的MDCK培養(yǎng)甲型流感疫苗株培養(yǎng)72h病毒的產(chǎn)量的增加有統(tǒng)計(jì)意義，從而篩選出分泌酶原為重組細(xì)胞活化病毒的最佳表達(dá)作用模式。 利用G418抗性篩選和有限稀釋法克隆，通過(guò)PCR、RT-PCR及間接免疫熒光鑒定，獲得了穩(wěn)定表達(dá)分泌型牛胰蛋白酶原的細(xì)胞株命名為MT21。將該單克隆細(xì)胞連續(xù)傳代15代次后仍可保持完整的外源基因，檢測(cè)連續(xù)傳代細(xì)胞表達(dá)上清胰酶活性沒有統(tǒng)計(jì)差異，目的蛋白表達(dá)穩(wěn)定。 將單克隆細(xì)胞MT21與正常MDCK細(xì)胞分別在有無(wú)外加低濃度（0.5μg/ml）TPCK-trypsin條件下，以0.001的感染復(fù)數(shù)接種野生H1N1、H3N2、B型流感病毒株及甲流疫苗株，收集無(wú)血清37℃培養(yǎng)24h、48h、72h的病毒測(cè)定NA活性、繪制病毒生長(zhǎng)曲線，檢測(cè)72h各病毒CCID50滴度，結(jié)果所有測(cè)試的毒株在MT21細(xì)胞上滴度高于在正常MDCK細(xì)胞上測(cè)定的結(jié)果，外加胰酶后差異更顯著，說(shuō)明我們構(gòu)建的MDCK-S.pro-try細(xì)胞系因分泌表達(dá)胰蛋白酶原而比MDCK細(xì)胞更適于流感病毒的增殖，不僅可以應(yīng)用至細(xì)胞流感疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)也為實(shí)驗(yàn)室有效分離培養(yǎng)和監(jiān)測(cè)流感病毒、致病機(jī)制研究、抗流感病毒藥物的篩選、中和抗體的測(cè)定等提供了重要的研究工具。
【關(guān)鍵詞】：人流感病毒 細(xì)胞流感疫苗 HA裂解 胰蛋白酶 MDCK細(xì)胞 G418篩選
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)食品藥品檢定研究院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-13
• 實(shí)驗(yàn)流程及技術(shù)路線13-14
• 第一部分 重組牛胰酶基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 MDCK細(xì)胞的功能研究14-38
• 引言14-15
• 一、實(shí)驗(yàn)材料15-16
• 二、實(shí)驗(yàn)方法16-27
• 三、結(jié)果27-33
• 1. 目的基因的克隆27-28
• 2. 重組表達(dá)載體的鑒定28-29
• 3. 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 MDCK 細(xì)胞的表達(dá)鑒定29-31
• 4. 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)目的蛋白酶活性檢測(cè)31-33
• 四、討論33-37
• 五、小結(jié)37-38
• 第二部分 穩(wěn)定表達(dá)分泌型胰酶原 MDCK 單克隆細(xì)胞的篩選及鑒定38-50
• 引言38
• 一、實(shí)驗(yàn)材料38-39
• 二、實(shí)驗(yàn)方法39-42
• 三、結(jié)果42-47
• 1. 篩選培養(yǎng)基中 G418 濃度的選擇42-43
• 2. 有限稀釋法篩選單克隆細(xì)胞43
• 3. MT21 基因組的 PCR 和 RT-PCR 鑒定43-44
• 4. MT21 細(xì)胞株目的蛋白的表達(dá)鑒定44-45
• 5. 連續(xù)傳代單克隆株基因組的 PCR 和 RT-PCR 鑒定45-46
• 6. 連續(xù)傳代單克隆細(xì)胞表達(dá)目的蛋白的酶活性檢測(cè)46-47
• 四、討論47-49
• 五、小結(jié)49-50
• 第三部分 流感病毒在穩(wěn)定表達(dá)胰酶原的 MDCK 細(xì)胞上的增殖特性研究50-63
• 引言50
• 一、實(shí)驗(yàn)材料50-51
• 二、實(shí)驗(yàn)方法51-54
• 三、結(jié)果54-59
• 1. 接種毒株 CCID_50滴度檢測(cè)54
• 2. 不同病毒株的細(xì)胞培養(yǎng)54-59
• 2.1 野毒株 A/天津津南/15/2009(H1N1)55-56
• 2.2 野毒株 A/福建同安/196/2009(H3N2)56-57
• 2.3 野毒株 B/黑龍江呼蘭/116/20105357-58
• 2.4 疫苗株 A/California/2009(H1N1)58-59
• 3. Western blot 鑒定不同細(xì)胞中 HA 的裂解情況59
• 四、討論59-62
• 五、小結(jié)62-63
• 全文總結(jié)63
• 后續(xù)需解決的問(wèn)題及工作計(jì)劃63-64
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 綜述：流感病毒血凝素蛋白裂解機(jī)制的研究進(jìn)展70-76
• 參考文獻(xiàn)74-76
• 縮略語(yǔ)表76-78
• 附錄一 測(cè)序比對(duì)結(jié)果78-81
• 附錄二 pcDNA3.1 載體圖譜81-82
• 致謝82-83

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 徐寧;姜楠;孫偉;李翠;;淺談流感病毒的HA突變與受體識(shí)別的關(guān)系[J];現(xiàn)代畜牧獸醫(yī);2013年09期

2 蔡孟華;李錚;董鵬;吳瑞平;何維;;高致病性禽流感病毒H5N1血凝素蛋白中和抗體及表位的鑒定[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2014年05期

3 凌志洋;張宏;邊超;孫兵;;廣譜流感疫苗的研究進(jìn)展[J];生命的化學(xué);2014年01期

4 徐康維;黃金鳳;許凱;李娟;邵銘;劉書珍;王軍志;李長(zhǎng)貴;;B型流感病毒血凝素的純化[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2014年03期

5 王祥;周東明;;基于血凝素(HA)的新型流感疫苗研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2014年09期

6 徐琦;何蕾;羅鵬;楊永耀;呂沁風(fēng);;流行性感冒病毒監(jiān)測(cè)及檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2014年33期

7 連孟洋;鄭青;房師松;;流感病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)的研究進(jìn)展[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2014年10期

8 莊麗;付琳;任麗娟;;貴州省2009～2011年度新型H1N1流感病毒HA1基因序列分析[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2013年17期

9 陳歡;李明義;高軒;;穩(wěn)定表達(dá)雞ST3GalⅠ的BHK-21細(xì)胞株的構(gòu)建及禽流感病毒的增殖[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2013年10期

10 戈勝?gòu)?qiáng);王志亮;;禽流感病毒受體研究歷程[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2013年10期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 ;FADD mediated activation of an apoptosis program in bovine follicular granulosa cells in vitro[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)養(yǎng)牛學(xué)分會(huì)2011年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

2 徐康維;李長(zhǎng)貴;許凱;李娟;邵銘;劉書珍;王軍志;;B型流感病毒血凝素純化[A];2012年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第十二屆中國(guó)藥師周論文集[C];2012年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 賈俊;重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞的研究[D];武漢大學(xué);2004年

2 陳

本文編號(hào)：274089