本文關鍵詞：穩(wěn)定表達牛胰蛋白酶的MDCK細胞的構建及對流感病毒增殖影響的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：流感疫苗是目前預防流感發(fā)生和傳播最為有效的手段。傳統(tǒng)的雞胚生產(chǎn)流感疫苗系統(tǒng)存在些不足之處，比如培養(yǎng)的流感病毒易發(fā)生抗原變異，與人群流行株不能完全匹配；殘留卵清蛋白易引起過敏反應；尤其當出現(xiàn)大流行時健康雞胚供應受限不能滿足短時間內(nèi)對疫苗的大量需求。而哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)能夠避免這些問題，成為未來疫苗生產(chǎn)的發(fā)展趨勢。臨床試驗表明使用MDCK等細胞生產(chǎn)的流感疫苗是安全的并有高免疫原性，然而較低的病毒滴度是其大規(guī)模生產(chǎn)的瓶頸之。流感病毒血凝素HA被宿主蛋白酶裂解為成熟的HA1和HA2，才能夠介導病毒囊膜與靶細胞膜融合，起始病毒生命周期，因此HA的裂解是病毒感染細胞的首要前提，而MDCK細胞本身并不具備裂解HA的蛋白酶類，成為產(chǎn)量提升的限制因素。研究證明外加胰蛋白酶能夠有效地提高病毒產(chǎn)量，本研究采取基因工程手段將胰蛋白酶基因?qū)隡DCK細胞，構建能夠自主表達裂解病毒的蛋白酶的細胞系，用于疫苗規(guī)模化生產(chǎn)，簡化生產(chǎn)工藝或更加有效地使疫苗產(chǎn)量提升。 胰蛋白酶本身存在酶原和酶兩種形式，而自然狀態(tài)人呼吸道上皮細胞中，蛋白酶裂解HA可能發(fā)生在胞外、胞內(nèi)或與胞膜相關，為此我們構建了酶原和酶兩種形式，分泌、胞內(nèi)、跨膜3種細胞分布的共6種真核表達載體�；蚝铣闪送暾呐Ｒ鹊鞍酌副磉_序列，設計引物去除N端分泌信號肽或酶原激活肽的核苷酸序列，PCR擴增并克隆了分泌型酶原和酶、胞內(nèi)型酶原和酶的表達序列；借鑒跨膜絲氨酸蛋白酶HAT基因的跨膜區(qū)TM，設計引物使TM和胰酶基因各有部分序列重疊，采用重疊PCR擴增克隆出跨膜型酶原和酶的目的基因。6條目的序列引入Kozak序列和NheI和EcoRI酶切位點，保持正確的開放閱讀框，雙酶切連接至pcDNA3.1真核表達載體，從而構建了3種細胞分布2種酶型的真核重組表達質(zhì)粒。 大量提取無內(nèi)毒素高純度的表達質(zhì)粒，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MDCK細胞，建立了目的基因的瞬時表達體系。免疫印跡實驗證明載體成功表達且表達蛋白大小符合預期，分別為分泌酶原24.3kD、分泌酶23.4kD、胞內(nèi)酶原24.3kD、胞內(nèi)酶23.4kD、跨膜酶原30.2kD、跨膜酶29.2kD。間接免疫熒光實驗顯示表達亞細胞分布正確。以特異熒光底物法檢測各型表達蛋白酶活性發(fā)現(xiàn)分泌型酶原的活性最高，轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒的MDCK培養(yǎng)甲型流感疫苗株培養(yǎng)72h病毒的產(chǎn)量的增加有統(tǒng)計意義，從而篩選出分泌酶原為重組細胞活化病毒的最佳表達作用模式。 利用G418抗性篩選和有限稀釋法克隆，通過PCR、RT-PCR及間接免疫熒光鑒定，獲得了穩(wěn)定表達分泌型牛胰蛋白酶原的細胞株命名為MT21。將該單克隆細胞連續(xù)傳代15代次后仍可保持完整的外源基因，檢測連續(xù)傳代細胞表達上清胰酶活性沒有統(tǒng)計差異，目的蛋白表達穩(wěn)定。 將單克隆細胞MT21與正常MDCK細胞分別在有無外加低濃度（0.5μg/ml）TPCK-trypsin條件下，以0.001的感染復數(shù)接種野生H1N1、H3N2、B型流感病毒株及甲流疫苗株，收集無血清37℃培養(yǎng)24h、48h、72h的病毒測定NA活性、繪制病毒生長曲線，檢測72h各病毒CCID50滴度，結果所有測試的毒株在MT21細胞上滴度高于在正常MDCK細胞上測定的結果，外加胰酶后差異更顯著，說明我們構建的MDCK-S.pro-try細胞系因分泌表達胰蛋白酶原而比MDCK細胞更適于流感病毒的增殖，不僅可以應用至細胞流感疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)，同時也為實驗室有效分離培養(yǎng)和監(jiān)測流感病毒、致病機制研究、抗流感病毒藥物的篩選、中和抗體的測定等提供了重要的研究工具。
【關鍵詞】：人流感病毒 細胞流感疫苗 HA裂解 胰蛋白酶 MDCK細胞 G418篩選
【學位授予單位】：中國食品藥品檢定研究院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-13
• 實驗流程及技術路線13-14
• 第一部分 重組牛胰酶基因真核表達載體的構建及瞬時轉(zhuǎn)染 MDCK細胞的功能研究14-38
• 引言14-15
• 一、實驗材料15-16
• 二、實驗方法16-27
• 三、結果27-33
• 1. 目的基因的克隆27-28
• 2. 重組表達載體的鑒定28-29
• 3. 瞬時轉(zhuǎn)染 MDCK 細胞的表達鑒定29-31
• 4. 瞬時轉(zhuǎn)染表達目的蛋白酶活性檢測31-33
• 四、討論33-37
• 五、小結37-38
• 第二部分 穩(wěn)定表達分泌型胰酶原 MDCK 單克隆細胞的篩選及鑒定38-50
• 引言38
• 一、實驗材料38-39
• 二、實驗方法39-42
• 三、結果42-47
• 1. 篩選培養(yǎng)基中 G418 濃度的選擇42-43
• 2. 有限稀釋法篩選單克隆細胞43
• 3. MT21 基因組的 PCR 和 RT-PCR 鑒定43-44
• 4. MT21 細胞株目的蛋白的表達鑒定44-45
• 5. 連續(xù)傳代單克隆株基因組的 PCR 和 RT-PCR 鑒定45-46
• 6. 連續(xù)傳代單克隆細胞表達目的蛋白的酶活性檢測46-47
• 四、討論47-49
• 五、小結49-50
• 第三部分 流感病毒在穩(wěn)定表達胰酶原的 MDCK 細胞上的增殖特性研究50-63
• 引言50
• 一、實驗材料50-51
• 二、實驗方法51-54
• 三、結果54-59
• 1. 接種毒株 CCID_50滴度檢測54
• 2. 不同病毒株的細胞培養(yǎng)54-59
• 2.1 野毒株 A/天津津南/15/2009(H1N1)55-56
• 2.2 野毒株 A/福建同安/196/2009(H3N2)56-57
• 2.3 野毒株 B/黑龍江呼蘭/116/20105357-58
• 2.4 疫苗株 A/California/2009(H1N1)58-59
• 3. Western blot 鑒定不同細胞中 HA 的裂解情況59
• 四、討論59-62
• 五、小結62-63
• 全文總結63
• 后續(xù)需解決的問題及工作計劃63-64
• 參考文獻64-70
• 綜述：流感病毒血凝素蛋白裂解機制的研究進展70-76
• 參考文獻74-76
• 縮略語表76-78
• 附錄一 測序比對結果78-81
• 附錄二 pcDNA3.1 載體圖譜81-82
• 致謝82-83

【共引文獻】

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本文編號：274089