【摘要】：霍亂是由霍亂弧菌(Vibrio cholerae)引起的急性腸道傳染病。始于1961年、至今未停息的第七次霍亂大流行由霍亂弧菌的01群E1Tor型引起。我國(guó)使用噬菌體-生物分型方案對(duì)El Tor型菌株進(jìn)行分型,并將E1Tor型菌株區(qū)分為流行株和非流行株兩類(lèi),長(zhǎng)期觀察發(fā)現(xiàn)流行株出現(xiàn)于霍亂流行期間、以及主要分離自病人,非流行株不感染人或偶引起腹瀉。從毒力基因上,流行株幾乎均為產(chǎn)毒株、非流行株均為非產(chǎn)毒株�；魜y弧菌烈性噬菌體VP2和VP4屬于噬菌體-生物分型方案中五個(gè)分型噬菌體中的兩個(gè)。了解分型噬菌體感染霍亂弧菌的機(jī)制,能夠明確已應(yīng)用多年的霍亂弧菌噬菌體-生物分型方案的機(jī)理,并且通過(guò)分析敏感菌株和抗性菌株之間與噬菌體感染相關(guān)的基因差異,對(duì)于了解El Tor型霍亂弧菌的遺傳多樣性和適應(yīng)性進(jìn)化均有重要的意義。 噬菌體感染細(xì)菌的第一步是受體識(shí)別,本研究以分型噬菌體的識(shí)別受體為研究目標(biāo),探索噬菌體敏感株和抗性株的受體差異。首先對(duì)分型噬菌體VP4進(jìn)行了全基因組測(cè)序。VP4為短尾噬菌體,基因組為線(xiàn)性雙鏈DNA,長(zhǎng)31693bp,G+C含量為46.8%。預(yù)測(cè)存在45個(gè)編碼基因,其中包括3個(gè)能預(yù)測(cè)到已知功能的基因。對(duì)噬菌體顆粒進(jìn)行了蛋白質(zhì)組的質(zhì)譜鑒定,有26個(gè)蛋白與預(yù)測(cè)的基因相對(duì)應(yīng),驗(yàn)證了這些基因預(yù)測(cè)的正確性,另外也展示了VP4顆粒中的噬菌體蛋白組成。 本研究中通過(guò)建立野生型VP4敏感株N16961的轉(zhuǎn)座子插入突變庫(kù),篩選到了9株VP4抗性突變株。在這些抗性株中,轉(zhuǎn)座子分別插入在manB、manC、 gmd、wbeN、wbeG、wbeU和recJ基因閱讀框內(nèi)部。manB、manC、gmd、wbeN、wbeG和wbeU屬于wbe基因簇,與霍亂弧菌O-抗原的合成相關(guān)。分別構(gòu)建manC、 wbeN、manB、wbeG、wbeU以及recJ的表達(dá)質(zhì)粒,分別回補(bǔ)到轉(zhuǎn)座子突變了相應(yīng)基因的突變株中,這些抗性株均回復(fù)為敏感株,提示了這些基因失活與產(chǎn)生VP4抗性有關(guān)；通過(guò)同源重組、自敏感株N16961構(gòu)建了manB、wbeN、wbeU和w6eG的基因缺失株,顯示這些缺失株對(duì)VP4感染產(chǎn)生了抗性,而把這些基因相應(yīng)回補(bǔ)到各缺失株中,均重新獲得了VP4感染的敏感性,證實(shí)了這些基因與VP4感染直接有關(guān)。我們選取了manB和wbeU缺失株,分析了其O-抗原的完整性,發(fā)現(xiàn)缺失株中O-抗原缺失、VP4不再吸附和感染裂解,回補(bǔ)相應(yīng)基因后O-抗原完整、重新獲得VP4的吸附和感染,證明了O-抗原是VP4的受體。recJ基因缺失后產(chǎn)生對(duì)VP4的抗性,回補(bǔ)后恢復(fù)敏感性,但是吸附實(shí)驗(yàn)證明其與VP4的吸附無(wú)關(guān),鑒于RecJ在其他細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的功能,我們推測(cè)其與VP4進(jìn)入宿主后的基因組復(fù)制相關(guān)。 為分析自然分離的VP4抗性菌株中O-抗原基因合成簇在其VP4抗性中的可能作用,我們對(duì)5株VP4天然抗性株wbe基因簇進(jìn)行了測(cè)序,發(fā)現(xiàn)部分基因出現(xiàn)了導(dǎo)致氨基酸殘基改變的突變以及靜息突變,通過(guò)分別回補(bǔ)相應(yīng)突變基因,證明這些自然抗性菌株中manB、wbeE和wbeU基因上的突變引起VP4感染的抗性,而在wbeU和manC基因上的突變沒(méi)有引起VP4的抗性。我們還發(fā)現(xiàn)有三株菌株在回補(bǔ)其突變基因后、仍沒(méi)有恢復(fù)VP4感染的敏感性,提示這些菌株可能還有其他VP4感染抗性機(jī)制。 我們利用構(gòu)建的轉(zhuǎn)座子突變庫(kù),還篩選了分型噬菌體VP2的抗性突變株。共得到5株VP2抗性株,測(cè)序發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子插入在VC1384、VC0760和VC0761基因內(nèi)部。進(jìn)一步利用同源重組自野生株N16961構(gòu)建了基因VC1384和VC0760的缺失株,發(fā)現(xiàn)VC0760基因缺失后只存在部分VP2抗性,VC1384缺失后產(chǎn)生了VP2抗性。白VC1384基因缺失株回補(bǔ)該基因后,恢復(fù)了VP2敏感性,但是吸附實(shí)驗(yàn)顯示VP2仍吸附于突變株。序列比對(duì)顯示VC1384編碼蛋白屬于OMP_b-br1家族成員,該家族中為跨膜蛋白,含有較多的p折疊,可形成孔道,因此推測(cè)VV1384基因產(chǎn)物可能與VP2的DNA注入有關(guān)。鑒于目前獲得的VC0760缺失株表型,提示還需要關(guān)注其上下游基因的功能。 在本研究中,我們通過(guò)鑒定到0-抗原為烈性噬菌體VP4的受體,分析了自然分離的霍亂弧菌VP4感染敏感菌株和抗性菌株的O-抗原合成基因簇的差異,利用該策略,我們能夠明確霍亂弧菌菌株的噬菌體敏感與抗性機(jī)制,并且明確不同菌株中的關(guān)聯(lián)到功能差異的基因組變異。自然水體中存在的霍亂弧菌噬菌體,能夠感染和殺滅針對(duì)該噬菌體敏感的菌株克隆,而對(duì)此噬菌體抗性的菌株得以在自然界中生存下來(lái),并可能導(dǎo)致流行。因此,我們鑒定到的這些針對(duì)VP4的抗性株,至少在存在VP4及其相似噬菌體的環(huán)境中,具有一定的生存優(yōu)勢(shì)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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1 王遠(yuǎn);朱曉輝;崔艷;劉萱;李平;彭莉;馬清鈞;曹誠(chéng);;霍亂弧菌O139多糖抗原的提取方法及優(yōu)化[J];生物技術(shù)通訊;2010年04期

本文編號(hào)：2740758