發(fā)布時(shí)間：2020-07-04 04:47

【摘要】： 目的:制備抗人B7-2人-鼠嵌合抗體(命名為ch1D1)并研究其抗腫瘤作用。 方法: 1、嵌合抗體ch1D1的制備、純化及效價(jià)鑒定 將穩(wěn)定分泌ch1D1的真核表達(dá)細(xì)胞株CHO-ch1D1,經(jīng)G418(濃度為500～800mg/mL)加壓篩選及亞克隆化培養(yǎng)后,挑選高表達(dá)株,無(wú)血清大批量培養(yǎng),收集上清。應(yīng)用Protein G親和層析法分離純化,紫外分光光度法定量。收集生長(zhǎng)良好的B7-2基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929-B7-2,5×10~5/管/100μL,分別按4μg、2μg、1μg及0.5μg/管加入ch1D1,經(jīng)間接免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)分析,以出現(xiàn)最高陽(yáng)性率時(shí)的最小用量定為抗體的效價(jià)。 2、嵌合抗體ch1D1對(duì)膜型B7-2分子的識(shí)別 收集生長(zhǎng)良好的Raji、Daudi(B系淋巴瘤細(xì)胞株)及Jurkat(T系淋巴瘤細(xì)胞株),1×105/管/100μL,分別加入ch1D1,1μg/管,間接免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)分析。同時(shí)以鼠源性的親本抗體1D1作抗體對(duì)照,并以L929-B7-2為細(xì)胞株的陽(yáng)性對(duì)照。 3、嵌合抗體ch1D1對(duì)Raji細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用研究將終濃度為10μg/mL ch1D1加入到Raji細(xì)胞中,共培養(yǎng)72h,MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。 4、嵌合抗體ch1D1Fc段介導(dǎo)的ADCC及CDC效應(yīng)分析取新鮮抗凝外周血,常規(guī)Ficoll分離法獲外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),以該細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞, Raji為靶細(xì)胞,加入終濃度為10mg/mL ch1D1,培養(yǎng)4h、24h、48h及72h,經(jīng)MTT法分析ch1D1介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)。以人血清作為補(bǔ)體來(lái)源,同法分析ch1D1介導(dǎo)的CDC效應(yīng)。 5、嵌合抗體ch1D1對(duì)Raji細(xì)胞體內(nèi)致瘤的抑制作用研究 選擇6周齡、雌性BALB/c裸鼠,隨機(jī)分為三組,10只/組,A組:單純接種Raji細(xì)胞,5×10~6/200μL/只;B組:Raji+ ch1D1;C組:Raji+1D1;接種部位為左腋皮下。運(yùn)用抗體組者,先分別將ch1D1及1D1(50μg/200μL)加在Raji細(xì)胞中結(jié)合30min后接種。逐日觀察腫瘤形成時(shí)間、成瘤率、腫瘤大小及裸鼠生存狀態(tài)等。 結(jié)果: 1、ch1D1的表達(dá)與效價(jià) 經(jīng)Protein G親和層析法分離純化,從CHO培養(yǎng)上清中獲取的目的抗體約為30mg/L。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析,該抗體用于間接免疫熒光分析的用量為1μg/5×105細(xì)胞。 2、ch1D1對(duì)膜型B7-2分子的識(shí)別 ch1D1與Raji、Daudi、Jurkat及L929-B7-2細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)合率分別為97.5%、96.5%、2.1%及97.2%。與鼠源親本抗體1D1的陽(yáng)性結(jié)合率(分別為99.6%、98.4%、2.3%及99.9%)相當(dāng)。 3、ch1D1對(duì)Raji細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用研究 ch1D1對(duì)Raji細(xì)胞增殖的抑制率在二者共培養(yǎng)72h時(shí)達(dá)27.1%。與B7-1嵌合抗體ch4E5聯(lián)合應(yīng)用,抑制率可達(dá)56.3%,較ch1D1單獨(dú)應(yīng)用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。ch1D1與Raji細(xì)胞共培養(yǎng)24h,細(xì)胞凋亡率為12.21%,與鼠源親本抗體誘導(dǎo)的凋亡率(12.44%)相當(dāng)。而聯(lián)合B7-1嵌合抗體ch4E5,其誘導(dǎo)的凋亡率上升為22.75%。 4、ch1D1Fc段介導(dǎo)的ADCC及CDC效應(yīng)分析 ch1D1介導(dǎo)PBMC對(duì)Raji細(xì)胞4h、24h、48h及72h的殺傷率分別為25.0%、52.0%、71.3%及72.7%;ch1D1介導(dǎo)補(bǔ)體對(duì)Raji細(xì)胞的殺傷率分別為39.4%、54.6%、60.3%及66.1%,與人IgG1及鼠源親本抗體比較均明顯升高(P0.05)。 5、ch1D1對(duì)Raji細(xì)胞體內(nèi)致瘤的抑制作用研究 Raji細(xì)胞經(jīng)ch1D1處理后接種的裸鼠,在70天的觀察期內(nèi)均未見(jiàn)腫瘤形成,裸鼠存活狀態(tài)良好。而單獨(dú)接種Raji細(xì)胞組,第30天形成肉眼可見(jiàn)的腫瘤結(jié)節(jié),成瘤率70%(7/10),腫瘤平均直徑2.8mm,70天腫瘤直徑達(dá)13.3mm。部分荷瘤鼠死亡。經(jīng)鼠源親本抗體處理組也未出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)。 結(jié)論:本研究成功制備了B7-2人-鼠嵌合抗體,體內(nèi)外研究結(jié)果均顯示該抗體具有良好的抗腫瘤作用。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

ch1D1的效價(jià)測(cè)定

圖 1-1 ch1D1 的分離純化Fig1-1 Disassociation and purification of ch1D1圖 1-2 ch1D1 的效價(jià)測(cè)定

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2740655