【摘要】：麻疹病毒血凝素蛋白(Hemagglutinin protein，H)是介導(dǎo)麻疹病毒吸附、侵入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵分子。CD46是被鑒定的麻疹病毒的第一個(gè)受體。我們從分離得到的麻疹病毒野毒株中發(fā)現(xiàn)了決定麻疹病毒血凝集性轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵位點(diǎn)，即和CD46相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)；進(jìn)一步研究了H蛋白對(duì)CD46的調(diào)控。人細(xì)胞表面的SLAM(signaling lymphocytic activation molecule)分子是2000年鑒定的麻疹病毒的第二受體。2001年，本室李凌云博士從絨猴B95a細(xì)胞cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了與SLAM高度同源的蛋白BIP，并且驗(yàn)證了它也能作為麻疹病毒的受體，我們稱為mSLAM。為了進(jìn)一步研究麻疹病毒第二受體SLAM(或mSLAM)在麻疹病毒侵染宿主過程中的作用，我們著重分析了麻疹病毒H蛋白和SLAM的相互作用。在本文研究結(jié)果和前人研究的基礎(chǔ)上，提出了麻疹病毒侵染宿主的可能機(jī)制。 首先我們確定了決定麻疹病毒血凝集性轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵位點(diǎn)：將來源于B95a細(xì)胞系、血凝集性為陰性的麻疹病毒株H基因進(jìn)行位點(diǎn)專一性突變(即專一性的將H基因的第1441位的A突變?yōu)門、相應(yīng)于H蛋白的第481位由Asn突變?yōu)門yr；第1636位的A突變?yōu)镚，相應(yīng)于H蛋白的第546位由Ser突變?yōu)镚ly)，并在COS-7細(xì)胞中表達(dá)含單點(diǎn)突變的H基因。在COS-7細(xì)胞表面表達(dá)的突變H蛋白能夠凝集非洲綠猴紅細(xì)胞(AGM-RBC)，且這種凝集作用可以被CD46分子的特異性抗體M75完全阻斷，從而證實(shí)這種凝集作用是通過突變H蛋白與CD46的相互結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，即單點(diǎn)突變的H蛋白(氨基酸第481位為Tyr或第546位為Gly)能夠與CD46受體結(jié)合，并導(dǎo)致AGM-RBC的凝集。證明H蛋白第481位和第546位氨基酸是決定其與CD46結(jié)合及血凝集性的重要位點(diǎn)，該位點(diǎn)的突變能夠改變H蛋白與CD46受體結(jié)合的能力，并導(dǎo)致血凝集性表型的改變。 文獻(xiàn)報(bào)道指出，麻疹病毒H蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)，以及被麻疹病毒感染 的細(xì)胞和未感染細(xì)胞的直接接觸能夠引起其受體CD46的表達(dá)下調(diào)。這里我們應(yīng) 用實(shí)時(shí)定量Rl飛PCR的方法檢測了CD46的mRNA水平在麻疹病毒感染細(xì)胞內(nèi)的 變化，發(fā)現(xiàn)其mRNA水平無明顯改變。為了進(jìn)一步研究CD46在麻疹病毒感染 細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，我們用流式細(xì)胞技術(shù)和間接免疫熒光技術(shù)檢測了CD46蛋白 表達(dá)。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出如下結(jié)論:用麻疹疫苗株S一191感染HeLa細(xì)胞 后，CD46的表達(dá)在mRNA水平和細(xì)胞表面的蛋白水平均未被下調(diào)。以往的研究 之所以提出CD46分子被麻疹病毒的感染所“下調(diào)”，我們認(rèn)為是由于H蛋白在 和CD46分子結(jié)合后，封閉了CD46抗體與CD46的結(jié)合位點(diǎn)，從而導(dǎo)致了CD46 分子被“下調(diào)”的假象。 采用PCR技術(shù)，我們構(gòu)建了一系列缺失突變的SLAM分子:缺失跨膜區(qū)和胞 內(nèi)區(qū);缺失N端信號(hào)膚;缺失C端;缺失N端。將這一系列缺失突變體分別克隆 到酵母表達(dá)載體pGAD424中，同時(shí)將麻疹病毒H基因克隆到酵母表達(dá)載體pGBTg 中。利用酵母雙雜交系統(tǒng)分析缺失突變的SLAM和H蛋白在酵母中的相互作用。 結(jié)果表明:SLAM分子上與H蛋白起關(guān)鍵作用的部位是N端27一135位氨基酸;SLAM 分子N端信號(hào)膚的缺失不影響其與H蛋白在酵母中的相互作用;SLAM分子的胞 內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)對(duì)其與H蛋白的結(jié)合沒有貢獻(xiàn);SLAM分子C端(136一227位氨基酸) 的缺失不影響其與H蛋白在酵母中的相互作用。 在初步確定SLAM分子上的27一135位氨基酸序列是與H蛋白作用的主要部位 后，我們將該序列克隆到原核表達(dá)載體pRSET中進(jìn)行表達(dá)純化。用純化后的SLAM 多膚27一135篩選噬菌體展示文庫，得到了6個(gè)與該多膚有高度親合力的短膚。 對(duì)這些短膚進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，有2個(gè)短膚的氨基酸序列與H蛋白429一438位氨 基酸序列很相似。由于這些短膚既與SLAM有高度親和力，又與H蛋白有序列上 的相似性，提示H蛋白429一438位氨基酸序列可能在H蛋白與SLAM的相互作用 中扮演重要角色。我們進(jìn)一步證實(shí)這些短膚能與H蛋白競爭結(jié)合SLAM，并且能 夠阻止麻疹病毒侵染宿主細(xì)胞。結(jié)果顯示:一方面這些短膚有望開發(fā)成麻疹病毒 侵染阻斷劑，另一方面H蛋白429~438位氨基酸序列可能是介導(dǎo)H和SLAM相互 作用的關(guān)鍵部位，為進(jìn)一步研究H蛋白與SLAM的相互作用提供了理想的切入點(diǎn)。 采用位點(diǎn)特異性突變技術(shù)，我們對(duì)H蛋白429一438位氨基酸序列進(jìn)行了單點(diǎn) 突變和多點(diǎn)突變，利用免疫共沉淀技術(shù)研究了突變后的H蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)的表 達(dá)情況以及突變后的H蛋白與SLAM在真核細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合情況。結(jié)果表明:H蛋 白上的429位Ser突變?yōu)锳la以及436位Thr和437位His突變?yōu)锳la后，H蛋 白喪失了與SLAM在真核細(xì)胞中結(jié)合的能力。提示H蛋白上的429位Ser、436位 Thr和437位HIS是H蛋白與SLAM分子相互作用的重要位點(diǎn)，盡管目前還不能確 定這些氨基酸的作用是因?yàn)槠浔旧淼睦砘再|(zhì)改變影響了H蛋白的結(jié)構(gòu)還是由 于其直接參與構(gòu)成了H上與SLAM結(jié)合的活性部位。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R373
【圖文】：

1.1.1麻疹病毒基因組結(jié)構(gòu)麻疹病毒基因組為非片段化(non-segmented)的單股負(fù)鏈RNACss卿A)�；蚪M全長約為16000個(gè)核昔酸，其基因組結(jié)構(gòu)模式如圖2所示【Hin~M.R.，2002]。麻疹病毒有6個(gè)結(jié)構(gòu)基因，對(duì)應(yīng)編碼6個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白。其中P基因可以編碼三個(gè)蛋白:P、e、v少a切山oM，2000]。麻疹病毒的基因組組成與其他副粘病毒科的病毒很相似:3’端52個(gè)核昔酸為前導(dǎo)子(Leader)，接著是基因間間隔區(qū)3’GAAS‘，接下來幾乎每一個(gè)基因間間隔區(qū)都有GAA序列，只有H基因與L基因的間隔區(qū)為3‘GcAS’[crowteyetal.1988]。每個(gè)基因的起始序列和終止序列中都存在共有序列(consensussequences)，其功能可能是mRNA合成和加工的信號(hào)。同時(shí)還有一個(gè)由36個(gè)核昔酸組成的5‘尾部。麻疹病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株Edmonst。n(Edm)的全基因組序列已被測定「Galinski

al.，1994](見圖3)。研究顯示，由于麻疹野毒株H基因的變異導(dǎo)致了病毒出現(xiàn)抗原性漂移(antigeniedrift)[Hu們nrnelK.B.，1995」。圖3麻疹病毒血凝素蛋白結(jié)構(gòu)模式圖〔PlemperR.K.，2000]

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 蘇建青;褚秀玲;;犬瘟熱病毒細(xì)胞受體研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī);2011年04期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 趙煒煒;麻疹疫苗S191生產(chǎn)用毒株遺傳穩(wěn)定性的研究[D];北京生物制品研究所;2008年

本文編號(hào)：2741065