【摘要】： 動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究是目前分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)內(nèi)容之一，其基本特征是改變動(dòng)物的遺傳組成，而改變動(dòng)物遺傳組成的目的是多種多樣的。在本研究中，我們希望通過(guò)改變動(dòng)物的遺傳組成來(lái)賦予轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一種新的性狀，所用的試驗(yàn)動(dòng)物為昆明小白鼠。 隨著生活水平的提高，肥胖日益成為一種嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明肥胖與人的糖尿病、心臟稿及高血壓有密切關(guān)系。由人肥胖基因編碼的瘦蛋白是調(diào)節(jié)脂肪代謝及體重的重要因子之一。能否用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)該種蛋白質(zhì)以及能否將該種蛋白質(zhì)用于治療與人肥胖有關(guān)的疾病是進(jìn)行這項(xiàng)研究的目的。 用包含兔乳清酸性蛋白基因啟動(dòng)子及其遠(yuǎn)端上游區(qū)(約6.3kb，-6300bp-+28bp)、人肥胖基因的編碼序列(約1.0kb)及兔乳清酸性蛋白基因終止子(約0.2kb)的三個(gè)質(zhì)粒經(jīng)亞克隆構(gòu)建了融合表達(dá)載體，在構(gòu)建表達(dá)載體之前，我們首先用AB1377 DNA測(cè)序儀對(duì)人肥胖基因進(jìn)行了序列測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表明該序列包含人肥胖基因第一外顯子的最后9bp，完整的第二外顯子(172bp)和第三外顯子的一部分(包括了全部的編碼序列和部分3′非翻譯區(qū))，編碼序列(504bp)中包含典型的翻譯起始密碼子ATG和終止密碼子TGA。用NotⅠ消化表達(dá)載體，回收包含上述三個(gè)表達(dá)元件且插入方向正確的片段(約7.5kb)，溶于TE(10 mmol／L Tris·C1，pH 7.4；0.1 mmol／LEDTA)后進(jìn)行顯微注射。注射用的DNA濃度為2μg/ml，每ml注射液中DNA的拷貝數(shù)約為2.4×10~(11)，每一枚原核期小鼠胚胎注射1 p1-2 p1。采用標(biāo)準(zhǔn)的顯微注射方法，獲得48只后代小鼠。四周齡對(duì)剪取0.1g左右的小鼠尾巴并提取尾組織DNA。根據(jù)rWAP啟動(dòng)子序列及人肥胖基因cDNA的序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，其序列如下： P_1：5′Tgg，AAg，gAC，Agg，ATg，ggg，Tgg，Ag—3′ P_2：5′—gAT,AAg，gTC，Agg，ATg，ggg，Tgg，Ag—3′ P_3：5′—ggg，ATC，CgT’gCC，gAT,CCA，AAA，AgT，CCA，AgA—3’ P_4：5′—CgA，ATF,CCC，TTC，AAg，gCC，TCA，gCA，CCC，Ag—3′ 對(duì)于上述兩對(duì)引物，預(yù)計(jì)P_1、P_2的擴(kuò)增長(zhǎng)度為1.1kb，P_3、P_4的擴(kuò)增長(zhǎng)度為460bp。隨后的擴(kuò)增結(jié)果表明該方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基岡小鼠的結(jié)果不夠穩(wěn)定。以人肥胖基因cDNA為探針，用EcoRI消化總組織DNA，經(jīng)Southern雜交反復(fù)確證其中兩只母鼠(2~#與C_3)為轉(zhuǎn)人肥胖基因小鼠。在出生的后代小鼠中，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率約為4％(2／48)。基于此，我們認(rèn)為采用PCR擴(kuò)增的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有費(fèi)用低和耗時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)，但容易受污染而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，通過(guò)Southern雜交的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雖然費(fèi)用高且耗時(shí)長(zhǎng)，但效果十分穩(wěn)定而可靠，我們建議直接采用Southern雜交的方法檢測(cè)始祖轉(zhuǎn)基因小鼠。兩只轉(zhuǎn)基因小鼠與非轉(zhuǎn)基因公鼠交配，妊娠足月分娩后，2~#與C_3分別生出7只和8只仔鼠，Southern雜交結(jié)果表明2~#與C_3所生出的仔鼠中各有3只為含有轉(zhuǎn)基因片段的仔鼠，這表明轉(zhuǎn)基因始祖小鼠可正常繁殖并可將轉(zhuǎn)基因傳遞給后代，其遺傳遵循孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。將產(chǎn)后第5d的轉(zhuǎn)基因小鼠與仔鼠隔離3h以上，并通過(guò)腹腔注射0.3IU的縮宮素和按摩乳房的方法采集其乳汁，以非轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)后第5天的奶樣為對(duì)照進(jìn)行SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE電泳的結(jié)果表明兩只轉(zhuǎn)始祖基因小鼠奶樣都較對(duì)照 一2一 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文 奶樣多出一條帶，大小約為16KDa，與人肥胖基因的表達(dá)產(chǎn)物瘦蛋白的分子量接近，初步估 計(jì)其表達(dá)量為lm留ml一Zm留ml。基于此我們認(rèn)為本研究中所構(gòu)建的表達(dá)載體是一個(gè)表達(dá)效果 良好的載體，6.3kb的r認(rèn)伙P啟動(dòng)子及其遠(yuǎn)端上區(qū)具有較強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)下游基因(包括cDNA)表 達(dá)的能力，可以用于構(gòu)建表達(dá)其它基因的表達(dá)載體。 通過(guò)該研究，我們建立了在乳腺中表達(dá)人瘦蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，轉(zhuǎn)基因得到較高水平 的表達(dá)。以之為基礎(chǔ)，在今后的研究中我們可以用該表達(dá)載體制作轉(zhuǎn)基因奶山羊或奶牛，該表 達(dá)載體在大型動(dòng)物的乳腺中可能同樣會(huì)有高水平的表達(dá)，從奶樣中分離純化該蛋白質(zhì)并通過(guò)動(dòng) 物臨床試驗(yàn)確定其生物學(xué)效應(yīng)，該產(chǎn)品可能能夠用于與人肥胖有關(guān)的疾病的治療。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2000
【分類(lèi)號(hào)】：R-332
【圖文】：

用于亞克隆的二個(gè)質(zhì)粒，pBluescriPt經(jīng)EcoRI消化可切出一條1.okb的人ob基因cDNA帶，質(zhì)粒pR經(jīng)EcoRI線(xiàn)性化可得到2.3kb的帶，p26經(jīng)Notl消化可得到2.okb及6.4kb的兩條帶，電泳結(jié)果與質(zhì)粒圖譜一致(見(jiàn)圖4):質(zhì)粒P2經(jīng)EcoRI酶切可切出一條】.okb的帶，正向插入時(shí)用BamHI可切出一條0.7kb大小的帶(見(jiàn)圖5):質(zhì)粒p22我們采用Notl不「1Hindlll雙酶切的方法鑒定其插入方向，用Notl和Hindlll雙酶切時(shí)，正向插入者可切出一條o.skb的帶，反向插入者可切出一條0.skb的帶(見(jiàn)圖6)。234圖4質(zhì)粒pBlueserip仁p民p26的酶切鑒定結(jié)果圖版說(shuō)明:Figure4IdentifiearionofthePlasmidsPBlueseriPt，PRandP26、ddermarkers:2.Notl酶切質(zhì)粒p26:3.EcoRI酶切質(zhì)粒pBlueseript:4，EeoRI酶切質(zhì)粒pRExPlanationofthefigure:1，1kbIaddermarkers:2

向插入時(shí)用BamHI可切出一條0.7kb大小的帶(見(jiàn)圖5):質(zhì)粒p22我們采用Notl不「1Hindlll雙酶切的方法鑒定其插入方向，用Notl和Hindlll雙酶切時(shí)，正向插入者可切出一條o.skb的帶，反向插入者可切出一條0.skb的帶(見(jiàn)圖6)。234圖4質(zhì)粒pBlueserip仁p民p26的酶切鑒定結(jié)果圖版說(shuō)明:Figure4IdentifiearionofthePlasmidsPBlueseriPt，PRandP26、ddermarkers:2.Notl酶切質(zhì)粒p26:3.EcoRI酶切質(zhì)粒pBlueseript:4，EeoRI酶切質(zhì)粒pRExPlanationofthefigure:1，1kbIaddermarkers:2，P26wasDigestedwithNotl:3，PBlueseriPtwasdigestedwithEeol:4，PRwasdigestedwithEeoRI

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 鄭月茂;轉(zhuǎn)基因山羊乳腺上皮細(xì)胞系建立與轉(zhuǎn)基因克隆胚發(fā)育[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前6條

1 李家連;抑制消減雜交法篩選中外豬種基因組差異研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2001年

2 劉金龍;人瘦蛋白乳腺表達(dá)載體的構(gòu)建及細(xì)胞表達(dá)的初步研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2004年

3 鄭艷玲;人胰島素基因乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2006年

4 趙樂(lè);新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物—西藏小型豬氟烷基因、瘦素基因研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2007年

5 郭磊;山羊BLG/CMV調(diào)控序列指導(dǎo)hLF基因在細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)[D];揚(yáng)州大學(xué);2008年

6 劉雷;Bcr啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)EGFP表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的制備和初步鑒定[D];揚(yáng)州大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2735340