發(fā)布時間：2020-06-30 18:38

【摘要】： era基因是1986年測定大腸桿菌基因組序列時發(fā)現(xiàn)的一個開放讀框。后來的大規(guī)�；蚪M研究表明，它廣泛分布于生物界。Era蛋白的N端是一個典型的鳥苷酸結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域，與其它G蛋白有較高的同源性；C端含有一個RNA結(jié)合功能結(jié)構(gòu)域—KH結(jié)構(gòu)域。這種獨特的C端使Era蛋白有別于其它所有G蛋白而獨立成為一個新的G蛋白亞家族。研究這種從細菌到人類高度保守的新G蛋白家族成員對于探索自然并發(fā)現(xiàn)規(guī)律具有重要意義。 我的研究工作可以分為兩個部分。1、利用酵母雙雜交釣取人Era蛋白的結(jié)合蛋白。2、利用RNAi技術(shù)封閉人和鼠era基因在相應(yīng)細胞中的表達，觀察細胞發(fā)生的變化。 首先我們以hEra蛋白作為誘餌蛋白，從人era基因表達較高的胎肝cDNA文庫中，篩選得到了15個候選作用蛋白。其中A19候選作 ＄·f’＾f4＊f’．＾ 用蛋白片段上包含了一個 NTR／C345C domain，這個結(jié)構(gòu)域能與 metz。nclns結(jié)合。Metzincins就是h離子依賴的一類金屬蛋白酶。鑒 于陳南春高級實驗師釣取的細菌Era結(jié)合蛋白YggG就是一種Zn離子依 賴的金屬蛋白酶，所以我們把A19蛋白片段做為重點分析對象，做了體 外GST－pulldown實驗。結(jié)果表明，hEra蛋白在GTP存在情況下可以和 NTR／C345C domain結(jié)合。hEra蛋白和葉R／C345C domain相互作用的初 步結(jié)果為我們進一步研究提供了方向和線索。 另外我們還利用自行構(gòu)建的專門用于RNAi的ShRNA表達載體，在相 應(yīng)細胞內(nèi)降低了人和鼠era基因的表達。細胞生長曲線結(jié)果表明，人和 鼠era基因的表達下調(diào)，可以引起“S”形生長曲線右移；透射電鏡結(jié)果 也顯示，人和鼠era基因的表達下調(diào)后，絕大部分細胞都出現(xiàn)在分裂前 狀態(tài)。然而，卻很難看到處于分裂相的細胞；流式細胞議結(jié)果表明，GZ州 期細胞周期阻滯。 透射電鏡還觀察到era基因RNA干涉以后，人和鼠來源的細胞都 出現(xiàn)了多核仁的改變。KH domain突變體轉(zhuǎn)染細胞后，電鏡觀察也出現(xiàn) 了同樣的結(jié)果。核仁是rRNA前體生物合成的位置。這就表明era基因 參與了rRNA基因轉(zhuǎn)錄。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：Q343
【圖文】：

BOx一B·BOX一C、Box一D)，與真核Ras蛋白及其它G蛋白均無同源性。1999年，Chenx.等仁6，’〕完成了大腸桿菌Era蛋白的晶體結(jié)構(gòu)分析。在結(jié)晶體中，Era蛋白以二聚體的形式存在(圖1)，每個Era蛋白單體圖1大腸桿菌E咒蛋白晶體三維結(jié)構(gòu)示意圖FiglOverallstruetureof五eoljEra(dimerintheerystal)的空間結(jié)構(gòu)相同，可分為兩個結(jié)構(gòu)域:N端結(jié)構(gòu)域在氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)上都是一個典型的GTPase結(jié)構(gòu)域;C端結(jié)構(gòu)域則為Era所特有的空間結(jié)構(gòu)，其中含有一個pa二p折疊，paap折疊中的兩個螺旋形成HTH(helix一七urn一helix)結(jié)構(gòu)，HTH的轉(zhuǎn)角處含有KH結(jié)構(gòu)域的保守序列VIGxxGxxIK。KH結(jié)構(gòu)域是進化上相當(dāng)保守的一段序列，存在于許多RNA結(jié)合蛋白中，如K蛋白(hnRNP成分)〔8〕、FMRI(fragileXmentalretardationgene產(chǎn)物)〔

如果將DNA一BD與己知的誘餌蛋白質(zhì)X融合，構(gòu)建出BD一X質(zhì)粒載體;AD基因則與cDNA文庫、基因片段或基因突變體(以Y表示)融合，構(gòu)建出AD戎質(zhì)粒載體(見圖3)。兩個穿梭質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)化至酵母體內(nèi)表達。該酵母菌株含有特定報告基因(如LacZ，H工S3，LEUZ等)，并己經(jīng)去除了相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，因此本身無報告基因的轉(zhuǎn)錄活性。蛋白質(zhì)X和Y的相互作用導(dǎo)致了BD與AD在空間上的接近，從而激活UAS18

【引證文獻】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 黃勇;Era及其相互作用因子功能研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2007年

本文編號：2735675