【摘要】：細(xì)胞增殖(cell proliferation)和細(xì)胞凋亡(apoptosis)是兩種對立的最基本的細(xì)胞活動。在生理水平上這兩種生命活動緊密相關(guān)、相互調(diào)節(jié),它們的協(xié)調(diào)和平衡直接影響了細(xì)胞和組織的正常發(fā)育和體內(nèi)的動態(tài)平衡,也影響了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。從分子生物學(xué)角度來看,腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控決定了腫瘤的增殖和凋亡。 Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 2-like, BNIP2-like (BNIPL)是上海市腫瘤研究所通過大規(guī)模功能篩選獲得的影響細(xì)胞生長的人類新基因。該基因有5種亞型,通過SMART RACE的方法獲得了其中兩種的全長的cDNA序列,分別為BNIPL-v1和BNIPL-v2。序列分析表明,BNIPL-v1含有2147bp,BNIPL-v2含有2353bp,都有完整的3’端和5’端,起始密碼子為ATG,起始翻譯序列符合Kozak規(guī)律。BNIPL-v1開放閱讀框含1074bp,編碼357個氨基酸,預(yù)計(jì)分子量為39.7kDa;BNIPL-v2開放閱讀框含828bp,編碼275個氨基酸,預(yù)計(jì)分子量為30.9kDa。BNIPL-v1和BNIPL-v2在GenBank的登錄號分別為AY033000和AF193056。蛋白質(zhì)同源序列分析表明結(jié)果表明BNIPL-v1和人BNIP2、鼠BNIP2在蛋白質(zhì)水平有68%的同源;BNIPL-v2和人BNIP2、鼠BNIP2在蛋白質(zhì)水平有72%的同源。BNIPL蛋白含有兩個保守結(jié)構(gòu)域SEC14 domain和BCH domain。 BNIPL定位于染色體1q21.1區(qū)段,GFP融合蛋白亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明BNIPL蛋白在胞漿中表達(dá),Norther雜交結(jié)果表明BNIPL在人的正常的肺和胎盤組織中高表達(dá)。雖然BNIPL含有釀酒酵母Sec14p的SEC14 domain,但是基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在酵母細(xì)胞內(nèi)BNIPL并不能與釀酒酵母Sec14p蛋白功能互補(bǔ)。利用酵母雙雜交技術(shù),通過篩選人肺cDNA文庫,獲得了4個與BNIPL相互作用的候選蛋白:巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor, MIF),生長因子(growth factor, ervl (S. cerevisiae)-like, GFER),核苷二磷酸激酶B(nm23-H2/NDP(Nucleoside diphosphate) kinase B)和FK506結(jié)合蛋白38(FK506 binding protein 38,FKBP38)。利用GST Pulldown和Co-immunoprecipitate實(shí) WP=6 驗(yàn)分別在體外和體內(nèi)驗(yàn)證了BNIPL可以分別和MIF、GFER、nm23-H2和FKBP38發(fā)生蛋白質(zhì)的相互結(jié)合。 我們通過克隆集落形成實(shí)驗(yàn)和對細(xì)胞生長曲線的測定,研究發(fā)現(xiàn)BNIPL的過量表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長,并且通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸的外翻變化,發(fā)現(xiàn)BNIPL具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能。因?yàn)锽NIPL與其相互作用的蛋白FKBP38分別可以與Bcl-2結(jié)合,也就是說三種蛋白可以兩兩之間發(fā)生蛋白質(zhì)的相互結(jié)合,分析認(rèn)為BNIPL可能是參與了FKBP38-Bcl-2復(fù)合物的構(gòu)成或者復(fù)合物定位的調(diào)控,抑制Bcl-2的功能,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 為了進(jìn)一步研究MIF、nm23H2與BNIPL的相互作用對細(xì)胞生長的影響,以及它們相互作用的生物學(xué)意義,我們利用Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了可調(diào)控表達(dá)BNIPL,持續(xù)表達(dá)MIF或nm23-H2的Hep3B穩(wěn)定細(xì)胞株。利用流式細(xì)胞術(shù)來研究BNIPL及其相互作用的蛋白MIF和nm23-H2分別表達(dá)和共同表達(dá)對細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,BNIPL和nm23-H2分別具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能,兩者處于Bcl-2上游的兩條不同的調(diào)控途徑中,當(dāng)BNIPL和nm23-H2共同表達(dá)并發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用時,兩者相互抑制,表現(xiàn)為抑制細(xì)胞凋亡。 BNIPL參與細(xì)胞增殖的途徑是與MIF、GFER發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用。我們主要研究了BNIPL與MIF的蛋白質(zhì)相互結(jié)合,認(rèn)為BNIPL對細(xì)胞增殖的抑制作用,主要是抑制了MIF的促細(xì)胞生長的功能實(shí)現(xiàn)的;反之,MIF也可以通過與BNIPL結(jié)合抑制由BNIPL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。 本文的研究結(jié)果為進(jìn)一步確定BNIPL基因在細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控作用提供了一些有益的線索。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：Q987

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本文編號：2734800