【摘要】：目的：檢測豬骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)體外培養(yǎng)自發(fā)分化和誘導分化過程中Notch4mRNA、Notch4蛋白的變化趨勢,探討Notch4受體對MSCs體外向心肌細胞分化的影響。 方法：密度梯度離心法分離中華小型豬骨髓單個核細胞,貼壁培養(yǎng)法篩選出MSCs體外培養(yǎng),原代(PO)培養(yǎng)后按1：2比例每3天傳代一次。選取第1,2,3和4代(P1,P2,P3和P4)MSCs,連續(xù)鏡下觀察MSCs的形態(tài)變化,同時檢測自發(fā)分化和5-氮胞苷誘導分化狀態(tài)下它們Notch4mRNA水平和Notch4蛋白表達量的差異。Real Time RT-PCR定量檢測細胞Notch4mRNA表達量,以及心肌結(jié)構(gòu)基因和特異性基因的表達量,包括Cx43和cTnI; Western-blot法檢測不同細胞Notch4蛋白的表達水平；免疫細胞化學染色法檢測MSCs的表面標志(CD34、CD45、CD90和CD29)及心肌細胞特異性的蛋白表達,包括a-橫紋肌肌動蛋白(a-sarcomeric actin, a-actin)、心肌肌鈣蛋白-T (cardiactroponin-T, cTn-T)和連接蛋白43(connexin43, Cx43);以透射電鏡觀察分化細胞超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：5天可見貼壁圓形的MSCs逐漸出現(xiàn)多角狀突觸,呈長梭形,經(jīng)過7-10天培養(yǎng),原代(passage0, PO) MSCs形成均一的細胞克隆,融合70-80%;1：2傳代以后第二天細胞即可貼壁生長,細胞為多角長梭形,數(shù)量增殖到較多時呈漩渦狀生長。免疫細胞化學表型鑒定CD45(-), CD29(+), CD90(+)。豬骨髓來源的MSCs在體外正常培養(yǎng)狀態(tài)下,隨著培養(yǎng)時間的延長(P0-P4),細胞之間的連接增多(Cx43表達量上升),心肌特異性標志物增多(cTnI表達量上升),與此同時Notch4較原代細胞顯著下調(diào)；5-氮胞苷(10μM)誘導2周后,Notch4的基因表達與對照組相比無明顯變化,Notch4陽性細胞與對照組相比顯著減少,各代MSCs可以生成更多的細胞連接,但是心肌特異性標志物無顯著變化。 結(jié)論：豬骨髓間充質(zhì)干細胞體外向心肌樣細胞分化過程中Notch4下調(diào)。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R329.2

【共引文獻】

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本文編號：2731439