【摘要】：目的：檢測(cè)豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)體外培養(yǎng)自發(fā)分化和誘導(dǎo)分化過程中Notch4mRNA、Notch4蛋白的變化趨勢(shì),探討Notch4受體對(duì)MSCs體外向心肌細(xì)胞分化的影響。 方法：密度梯度離心法分離中華小型豬骨髓單個(gè)核細(xì)胞,貼壁培養(yǎng)法篩選出MSCs體外培養(yǎng),原代(PO)培養(yǎng)后按1：2比例每3天傳代一次。選取第1,2,3和4代(P1,P2,P3和P4)MSCs,連續(xù)鏡下觀察MSCs的形態(tài)變化,同時(shí)檢測(cè)自發(fā)分化和5-氮胞苷誘導(dǎo)分化狀態(tài)下它們Notch4mRNA水平和Notch4蛋白表達(dá)量的差異。Real Time RT-PCR定量檢測(cè)細(xì)胞Notch4mRNA表達(dá)量,以及心肌結(jié)構(gòu)基因和特異性基因的表達(dá)量,包括Cx43和cTnI; Western-blot法檢測(cè)不同細(xì)胞Notch4蛋白的表達(dá)水平；免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)MSCs的表面標(biāo)志(CD34、CD45、CD90和CD29)及心肌細(xì)胞特異性的蛋白表達(dá),包括a-橫紋肌肌動(dòng)蛋白(a-sarcomeric actin, a-actin)、心肌肌鈣蛋白-T (cardiactroponin-T, cTn-T)和連接蛋白43(connexin43, Cx43);以透射電鏡觀察分化細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：5天可見貼壁圓形的MSCs逐漸出現(xiàn)多角狀突觸,呈長(zhǎng)梭形,經(jīng)過7-10天培養(yǎng),原代(passage0, PO) MSCs形成均一的細(xì)胞克隆,融合70-80%;1：2傳代以后第二天細(xì)胞即可貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞為多角長(zhǎng)梭形,數(shù)量增殖到較多時(shí)呈漩渦狀生長(zhǎng)。免疫細(xì)胞化學(xué)表型鑒定CD45(-), CD29(+), CD90(+)。豬骨髓來源的MSCs在體外正常培養(yǎng)狀態(tài)下,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)(P0-P4),細(xì)胞之間的連接增多(Cx43表達(dá)量上升),心肌特異性標(biāo)志物增多(cTnI表達(dá)量上升),與此同時(shí)Notch4較原代細(xì)胞顯著下調(diào)；5-氮胞苷(10μM)誘導(dǎo)2周后,Notch4的基因表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯變化,Notch4陽性細(xì)胞與對(duì)照組相比顯著減少,各代MSCs可以生成更多的細(xì)胞連接,但是心肌特異性標(biāo)志物無顯著變化。 結(jié)論：豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外向心肌樣細(xì)胞分化過程中Notch4下調(diào)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2731439